1.1材料

1.1.1实验动物 雄性健康Sprague-Dawley大鼠（由浙江省医学科学院动物中心提供36只，体重250±20克。

1.1.2主要试剂 TRIzol试剂（美国 Invitrogen life technologies公司），Oligo（dT）、dNTP、M-MLV、Taq酶(均为美国Promega 公司产品)。iNOS兔抗鼠多克隆抗体购自武汉博士德公司，EnVision HRP标记的羊抗鼠IgG（即用型）为DAKO公司产品。

1.1.3.聚合酶链反应（PCR）引物 iNOS：正链5’-GGA GGA GCT GAT GGA GTA GTA GCG G-3’，负链5’-CTA CCT ACC TGG GGA ACA CCT GGG-3’，特异扩增片段为442bp；GAPDH：正链5’-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3’，负链5’-GGT GGT GAA GAC GCC AGT AG-3’, 特异扩增片段为305bp。所有的引物由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1.动物模型及分组 制备左侧输尿管梗阻模型组（UUO组，30只），分术后4小时，12小时，24小时，3天和7天5个处死组各6只，同时设假手术组（C组，6只）作为对照组。大鼠以乙醚吸入麻醉，腹部正中切口，双重结扎左侧输尿管，缝合腹壁。假手术组未结扎左侧输尿管，其他同前。所有动物均给予常规饮食和饮水。分别于术后4小时，12小时，24小时，3天和7天处死大鼠，取出梗阻肾脏。部分组织用液氮速冻，后转入－86℃冰箱保存；其余以4%中性甲醛固定，石蜡包膜，以备常规染色和免疫组化用。

1.2.2逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 将100mg冻存组织在液氮中碾磨成粉末状，加入1ml TRIzol试剂提取组织总RNA。取RNA2ug用于逆转录，20ul反应体系包括50 pmol Oligo（dT）15 1ul,10mmol/L dNTP 2ul,M-MLV 200U。2ul 逆转录产物用于PCR扩增反应，25ul 反应体系中包括10mmol/L dNTP 1ul,Taq酶1.5U，上游和下游引物各10pmol。PCR反应条件为：94度预变性4min，然后30个循环的扩增，最后72度延伸10min.每个循环包括94度变性45s,58度退火45s,72度延伸60s.10ul PCR产物经1.5%琼脂糖电泳，溴化乙啶染色。通过凝胶成像系统（美国Kodak公司）读取目的电泳条带的密度扫描值，将iNOS条带与GAPDH条带的比值作为iNOS的表达相对量。

1.2.3 免疫组化：采用EnVision?两步法，按照免疫组化常规步骤操作。石蜡切片的抗原修复采用pH6.0 10 mmol/L柠檬酸抗原修复液, 高压锅加帽出气后3 min，快速冷却；iNOS多克隆抗体(抗体稀释比1：100) 37 ℃ 60min；用已知的阳性标本作阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。有胞浆棕黄色为iNOS阳性染色细胞。结果判断：在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为阴性（0分），阳性细胞率在25%以下为弱阳性（2分），25%-50%为阳性（4分），50%以上为强阳性（6分）。

1.3统计方法

数据以平均数±标准差（_ x±s）表示，数据经正态分布检验，均数间结果比较用方差分析。所有资料均在SPSS11.5软件下操作。P<0.05定为统计学差异有显著性。

2.1肾脏病理改变

肾脏的大体改变：UUO组梗阻侧肾脏重量增加，并出现不同程度肾盏和肾盂扩张，随着梗阻时间的延长，扩张程度也明显。光镜改变：UUO组梗阻侧肾脏的肾单位表现为集合管管腔扩张，上皮萎缩，越接近肾盂侧（远侧肾小管）越明显，近曲小管改变轻微，而肾小球保持正常结构。在炎细胞浸润方面，UUO组的梗阻侧肾脏与假手术组相比，UUO术后4h梗阻侧肾脏未见明显的病理变化，1d后见小血管周围有少量的炎细胞浸润，第3d时炎细胞浸润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎细胞浸润（图1）。第7d时炎细胞浸润增多并达到高峰，以单核巨噬细胞为主（图2）。

2.2两组大鼠肾组织iNOSmRNA表达水平

RT-PCR的结果显示：与假手术组大鼠比较，单侧输尿管梗阻后仅4h大鼠梗阻侧肾皮质中即可见iNOS的mRNA表达轻度增强，于第24h明显增强，第3d达到高峰，以后大鼠梗阻侧肾皮质中iNOS的mRNA表达逐渐减弱，于第7d时最低（表1）。分析各组iNOS与GAPDH光密度比值发现，UUO术后4h,12h,24h,3d各组大鼠的光密度比值明显高于假手术组（P<0.01），梗阻第7d大鼠梗阻侧肾皮质iNOS的mRNA表达与假手术组大鼠肾脏比较，其差异无明显（图3）。

2.3 iNOS的分布与含量

iNOS在对照组大鼠肾脏的皮质的远、近曲小管呈低水平表达。UUO组iNOS主要分布在髓质和皮质的远曲小管，而在近曲小管的表达量较少。UUO组iNOS的蛋白表达量从单侧输尿管梗阻后12h开始明显增加，第3d达到高峰（图4），以后大鼠梗阻侧肾皮质中iNOS的蛋白质表达量逐渐减弱（表1）。

有关由UUO引起的梗阻性肾病的发病机制目前尚未完全清楚，大多数学者倾向认为本病的发生是以梗阻为启动因素所诱导的多种血管活性物质、生长因子、细胞因子等综合作用的结果。iNOS在UUO中起着重要作用，其作用主要通过其产物NO表现出来。现已经知道NO在UUO的早期起着调节肾脏血流动力学的作用，而Hegarty^[1]则认为NO在UUO的肾脏低灌注期仍起着血管舒张作用。之前许多研究表明通过提高NO可以改善梗阻性肾病尤其肾间质纤维化，如通过血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）或L-精氨酸的治疗都能使间质纤维化明显减轻，而这两者均被证明可以使NO的产生增加；通过左旋精氨酸甲酯(L-NAME)抑制NOS不但可以逆转上述药物对UUO的治疗效果，而且单独使用时可加重肾间质纤维化^[2]，则进一步说明NO的保护作用。上述L-NAME通过抑制NOS由于缺乏特异性，不能由此判断某种NOS的作用，所以Hochberg^[3]采用iNOS-/-小鼠进行实验，结果说明由于iNOS的缺失，使梗阻肾的纤维化加重，这个结果说明iNOS（通过合成的NO）在UUO中起保护作用。

现已知道在UUO引起的众多病理变化中，肾小管萎缩和肾组织的减少可能和肾小管细胞的凋亡有关^[4,5]。在UUO中，随着肾内压力的增高导致肾小管细胞被牵张，故有人认为机械牵伸可能也是一种促进凋亡的因素。Miyajima^[6]通过实验证实在UUO中肾小管细胞的凋亡机制和机械牵伸有关，而NO显示出抗凋亡的作用。作者同样通过iNOS-/-小鼠实验证明了在三种NOS都存在的情况下，iNOS显得尤其重要。

本研究利用RT-PCR和免疫组化技术，发现在UUO状态下肾脏中iNOS的mRNA和蛋白水平表达显著上调，这充分说明上调的iNOS参与了UUO后肾脏损伤的早期病理生理过程，并在其中起到内源性的保护作用，有关iNOS起保护作用的类似报道也可见于急性脑缺血损伤^[7]。可以推测促进iNOS表达,进而提高NO的产量将会对梗阻性肾脏损伤起到保护作用，这在治疗急性上尿路梗阻病变上具有潜在价值。

1. Hegarty N J, Young L S, Kirwan C N, et al. Nitric oxide in unilateral obstruction: Effect on regional renal blood flow. Kidney Int, 2001,59:1059-1065
2. Morrissey J J, Ishidoya S, McCracken R, et al. Nitric oxide generation ameliorates the ubulointerstitial fibrosis of obstructive nephropathy. J Am Soc Nephrol,1996,7:2202-2212
3. Hochberg D, ohnson C W,Chen J,et al. Interstitial fibrosis of unilateral obstruction is exacerbated in kidney of mice lacking the gene for inducible nitric oxide synthase. Lab Ivest,2000,80:1721-1728
4. Sawczuk I S, Hoke G, Olsson C A, et al.Gene expression in response to acute unilateral ureteral obstruction. Kidney Int,1989,35:1315-1319
5. Truong L D, Petrusevska G, Yang G, et al. Cell apoptosis and proliferation in experimental chronic obstructive uropathy. Kidney Int,1996,50:200-207
6. Miyajima A, Chen J, Poppas D P, et al. Role of nitric oxide in renal tubular apoptosis of unilateral ureteral obstruction. Kidney Int, 2001,59:1290-1303
7. 江观玉，姚瑜，周佳音，等。氨基胍对大鼠脑缺血-再灌流损伤后脑微血管通透性的影响。中华急诊医学杂志，2001，10：383-385 （Jiang Guanyu , Yao Yu , Zhou Jiayin , et al. The effect of aminoguanidine on microvascular permeability after cerebral ischemia/ reperfusion. Chin J Emerg Med , 2001,10: 383-385）

表 1 各组大鼠左肾组织iNOSmRNA的相对表达量和蛋白表达水平

Table 1． Expression of iNOS mRNA and protein in kidneys after UUO

﹡与对照组相比(compare with control)，P<0.01

Fig.2 Morphologic changes of kidney at 3-day after UUO（HE×200）

Fig.2 Morphologic changes of kidney at 7-day after UUO（HE×200）

图 3 iNOS mRNA RT-PCR 产物电泳图

M：标准分子量，1：假手术组，2：UUO术后4h，3：UUO术后12h，

4：UUO术后24h，5：UUO术后3d，6：UUO术后7d

图 4单侧输尿管梗阻后3d肾组织iNOS表达免疫组化结果（EnVision×200）

Fig.4 Expression of iNOS in kidney at 3 days after UUO（EnVision×200）