脓毒症是一种由于宿主对感染的反应失调而引起的器官功能障碍综合征^[1]。2017年全球共有4 890万脓毒症病例，其中1 100万例死亡^[2]。脓毒症病情发展迅速，脓毒症患者的死亡率保持在25%~30%，合并休克时其病死率甚至高达40%~50%^[3]。脓毒症的高发病率和高死亡率如今仍是重症监护领域面临的一个棘手问题。目前脓毒症的治疗方法主要包括抗生素的使用、液体复苏和支持性护理等对症治疗^[4]。脓毒症的发病机制具有高度的复杂性和特异性，这也一直是脓毒症的主要研究方向。脓毒症发病初期，病原体会进入血液，激活免疫反应，触发细胞因子级联反应，释放大量促炎细胞因子^[5]。随着时间的推移，身体会出现全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）。同时，过度炎症会破坏内皮屏障的完整性，导致血管内蛋白质和血浆泄漏到血管外空间，致使组织水肿和微血管灌注减少^[6]。研究发现由病原体成分脂多糖和炎症细胞因子引发的坏死性凋亡，在脓毒症的发生发展中起着重要的作用。

1 坏死性凋亡概述

生物体的发育过程不仅取决于受调控的细胞增殖，还取决于如何处理生物体不再需要的细胞或构成潜在危险的细胞^[7]。程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）是生物体协调消除这些细胞的主要方式。过去三十年的研究已经定义了几种不同类型的PCD，主要包括凋亡、自噬、铁死亡、坏死性凋亡和焦亡等^[8]。其中坏死性凋亡是一种因质膜上孔隙或其他缺口形成导致的裂解性细胞死亡形式^[8]，它不会导致DNA片段化或凋亡样的形态变化。与细胞凋亡相反，坏死性凋亡被认为是细胞死亡的一种炎症形式，它通过释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），如高迁移率组蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1）、细胞因子和组蛋白，导致许多炎症性疾病。

1.1 坏死性凋亡的分子机制

坏死性凋亡的多种成分，包括Z-DNA结合蛋白1（Z-DNA–binding protein 1, ZBP1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptorinteracting protein kinase 3, RIPK3）、混合谱系激酶结构域样假激酶（mixed lineage kinase-like, MLKL）和肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1）驱动核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的激活并影响所谓的“炎症小体”的控制，有助于活化capase-1并随后分泌IL-1β和IL-18^[9]。

坏死性凋亡由许多细胞内外受体与其各自的配体结合后引发。这些受体包括TNFR、FasL、Toll样受体（toll-like receptor, TLR)，干扰素受体（interferon-γ, IFN-γ）和ZBP1^[10-11]。虽然每个受体复合物中涉及的衔接蛋白因受体类型而异，但它们都通过坏死小体发出信号，从而导致坏死性凋亡。坏死小体的确切组成也可能有所不同，但核心成分都包括RIPK1、RIPK3和MLKL^[12-13]。坏死性凋亡可参与多种信号通路的调节，包括caspase-8依赖的细胞凋亡通路、丝裂原活化蛋白激酶级联反应和NF-κB信号通路的激活^[14]。当TNFa与其受体TNFR1或TNFR2结合后，细胞内衔接分子Fas相关死亡结构域蛋白（fas-associating death domain-containing protein，FADD）和TNFR相关死亡结构区蛋白募集受体与RIPK1相互作用，并随后在caspas-8失活的情况下经过一系列过程来招募RIPK3，RIPK3介导的磷酸化通过促进转位到质膜和破坏质膜来激发MLKL^[15]的杀伤活性。活化的MLKL可以导致DAMPs的释放和坏死性凋亡，其介导膜通透性的机制尚不清楚^[10-11]。有人提出，当MLKL在质膜的局部积累超过了临界阈值水平时，膜的完整性就会受到影响，细胞随之死亡^[16]。

溴结构域蛋白4（bromodomain protein 4, BRD4）是一种新发现的坏死性凋亡的表观遗传学调节因子。最新研究表明BRD4与乙酰化的IRF1相互作用，并与正转录延长因子b（positive transcription elongation factor b, P-TEFb）和RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase II, RNA-POL Ⅱ）结合形成转录复合体，形成的复合物BRD4/IRF1/P-TEFb/RNA-POLⅡ占据MLKL基因的启动子区调节MLKL的表达^[17]。在某些细胞类型中，坏死性凋亡可以独立于RIPK1进行，因为含有RIP同型相互作用基序（RIP homotypic interaction motif, RHIM）的ZBP1或TLR3/4接触TRIF可以直接与RIPK3相互作用^[18-19]。

1.2 翻译后修饰对坏死性凋亡的调控作用

研究发现，磷酸化、泛素化、糖基化、蛋白水解裂解和二硫键等翻译后修饰在调节坏死性凋亡信号转导中有着广泛的作用^[20]。RIPK1受到翻译后修饰的严格调控。许多亚磷酸盐会影响RIPK1的催化活性，从而参与细胞死亡信号传递。据报道，RIPK1不是通过经典的磷酸化级联反应促进坏死性凋亡，而是依赖RIPK1自身磷酸化来启动通路^[21]。近期一项研究未能在内源性RIPK1中检测到S161磷酸化，这表明这种磷酸化事件对RIPK1调控的作用可能取决于细胞和周围环境^[22]。RIPK1在TNFR1复合体I中高度泛素化，它是调节细胞生存、凋亡和坏死性凋亡的信号平台^[20]。然而，泛素化位点很少被表征，泛素化位点和泛素修饰酶之间联系的证据也很少。虽然抑制RIPK1的活性也会抑制RIPK3的磷酸化，但在体外的激酶检测中没有观察到RIPK1对RIPK3的磷酸化^[12]。RIPK3似乎受到E3泛素连接酶、CHIP和PELI1的K48连接泛素化的调节，从而诱导RIPK3的降解以抑制坏死性凋亡^[23-24]。有研究报道，氨基己糖生物合成途径的O-GlcNAc转移酶（OGT）在RHIM基序附近介导小鼠RIPK3在T467上的O-连接β-NGlcN酰化反应^[25]。这一修饰被认为抑制了RIPK1和RIPK3之间的相互作用，原因可能是由于RHIM结构域之间的空间位阻。RIPK3对MLKL假激活域的激活环进行磷酸化可能是MLKL激活的标志。磷酸化可以触发MLKL假激酶域的构象变化，其通过支架区域的双螺旋连接器与N端4HB结构域进行信号传递^[26]。硫氧还蛋白-1通过减少MLKL4HB结构域半胱氨酸来防止寡聚体的形成来抑制坏死性凋亡。在人和鼠细胞系中，RIPK3对假激酶结构域（鼠MLKL的S345^[27]，人MLKL中的T357/S358^[28]）的激活环的磷酸化先于坏死性凋亡^[26]。

1.3 坏死性凋亡的病理生理变化

坏死性凋亡可发生在多种病理生理过程中，包括感染、肝脏疾病、肾脏损伤、神经退行性疾病、心血管疾病和肿瘤等。细胞发生坏死性凋亡时的形态学特征是细胞膜完整性丧失、细胞质的透明化、线粒体和内质网肿胀以及细胞溶解。坏死性凋亡早期的生化变化包括ATP消耗、活性氧产生、钙超载，线粒体通透性转换的丧失，这可能与随后的免疫反应和氧化应激有关^[29]。坏死性凋亡被激活后释放的介质提供促炎信号，通过招募免疫细胞来刺激有效的抗菌反应，并激活组织修复机制^[30]。坏死性凋亡中主要的调节蛋白还具有不依赖于细胞死亡的功能，如调节炎性小体激活、调节线粒体功能和其完整性以及调节细胞代谢活动等^[31]。

2 坏死性凋亡在脓毒症中的作用 2.1 坏死性凋亡与脓毒症炎症反应

研究结果表明，坏死性凋亡在感染性炎症中起着的关键作用。在病毒感染期间，这些病毒利用宿主的信号通路，如抗凋亡蛋白，来加重感染，从而增强其在宿主细胞中的复制能力。例如，单纯疱疹病毒-1和-2编码含有RHIM的蛋白ICP6和ICP10，通过RHIM阻止RIPK1和RIPK3的相互作用来阻断肿瘤坏死因子诱导的坏死性凋亡^[32]。Lien等^[33]发现焦亡和坏死性凋亡是登革热病毒和病毒粒子表面包膜蛋白结构域Ⅲ诱导血小板RCD的两种主要类型，分别约有55%~60%和20%~25%的RCD阳性标志物群体。有研究表明，流感病毒和其他正黏液病毒中Z-RNAs与ZBP1蛋白结合，启动依赖RIPK3的MLKL激活和坏死性凋亡^[34]。另外，病毒已经进化出逃避坏死性细胞死亡机制的事实证明了坏死性凋亡在对抗微生物感染方面的重要性。

肠道致病性大肠杆菌已被证明合成并分泌大量免疫原性效应蛋白NleB1并修饰FADD和RIPK1抑制坏死性凋亡的结构域，缺乏NleB1的肠道致病性大肠杆菌不能定植于肠上皮细胞，这表明细菌坏死性凋亡是生物体的一种保护机制^[35]。在耶尔森氏菌感染的背景下，研究发现RIPK3介导的坏死性凋亡对宿主是有益的^[36]。而金黄色葡萄球菌感染导致肺泡巨噬细胞发生坏死性死亡，这对宿主不利^[37]。在鼠伤寒沙门氏菌静脉感染模型中，RIPK3基因敲除显著减少了脾巨噬细胞的死亡，从而延长了小鼠的存活时间^[38]。Hu等^[39]通过口服鼠伤寒沙门菌的炎症模型研究结果表明，沙门菌外蛋白B在感染过程中下调，导致细菌移位，增加巨噬细胞坏死性凋亡，并加剧细菌感染。在疟疾和利什曼病等寄生虫感染中发现也会发生坏死性凋亡^[40]。

2.2 坏死性凋亡与脓毒症组织损伤

在脓毒症中血管内皮屏障的破坏导致血管通透性增加和促炎细胞因子的过度产生，从而进一步促进炎症细胞迁移和渗入器官，进而启动和或加重组织损伤。Chen等^[41]发现RIPK3/GSDMD或MLKL/GSDMD的双重缺失消除了TNFα在内皮细胞中诱导的细胞死亡和渗透能力，表明RIPK3和GSDMD通过促进内皮细胞坏死性凋亡和焦亡共同诱导并加重了内皮屏障破坏。Bolognese等^[42]利用小鼠腹腔内多菌脓毒症模型证明使用RIPK1的抑制剂NEC-1，可以减轻脓毒症小鼠全身和肺部的炎症，减轻肺损伤，并减少中性粒细胞趋化因子的表达和细胞凋亡的数量。在脂多糖诱导的脓毒症仔猪模型中发现，当使用NEC-1预处理可使RIPK1、RIPK3、MLKL、磷酸甘油酸变位酶5和HMGB1表达减少，从而减轻脓毒症仔猪的肝损伤和肠损伤^[43-44]。Beno等^[45]报告，在肺炎链球菌小鼠模型中，心肌细胞的死亡和心脏的损伤是由坏死性凋亡的作用决定的，抑制坏死性凋亡减轻了心肌的损伤。实验研究表明，过氧化物酶体增殖剂激活受体γ通过抑制细胞凋亡和坏死性凋亡来减少心脏炎症，缓解脓毒症相关的心肌病^[46]。

2.3 坏死性凋亡与脓毒症中免疫调节

在脓毒症中，入侵的病原体可以引起机体免疫失调，从而形成一种免疫抑制为特征的病理综合征^[47]。作为一种先天免疫机制，坏死性凋亡在脓毒症免疫调节方面发挥着关键作用。在动物中发现的病毒和细菌蛋白可以在信号通路的不同阶段阻止坏死性凋亡，这些发现支持了坏死性凋亡是先天性宿主防御机制的观点^[20]。及时清除因感染等刺激而克隆扩增的活化T淋巴细胞对于维持T细胞稳态至关重要，因为其失调会导致免疫缺陷。一些报道表明，坏死性凋亡在T细胞发育过程中可以调节外周组织中T细胞的数量。有研究从死于脓毒症的受试者身上获得的T细胞中发现程序性死亡配体1的表达增加，表明T细胞功能受到抑制^[48]。有研究发现caspase-8-RIPK3和FADD-RIPK3双缺陷的小鼠体内积累了过量和异常的淋巴细胞，提示RIPK3驱动的坏死性凋亡参与了淋巴细胞在发育过程中的清除^[49]。Sharma等^[50]使用RIPK3缺陷小鼠建立CLP模型发现，发现RIPK3缺乏抑制了免疫细胞（中性粒细胞、自然杀伤细胞和CD8T细胞）的渗透，减轻了器官损伤。目前，关于坏死性凋亡在脓毒症免疫机制中的相关研究仍较少，但如何有效地调节免疫细胞的坏死性凋亡将会是脓毒症治疗的一个潜在方向。

3 坏死性凋亡在脓毒症中的应用与治疗

坏死性凋亡在脓毒中的诊断和治疗中也发挥着重要作用。Yoo等^[51]发现脓毒症的一种潜在生物标志物HMGB1与RIPK3、MLKL呈正相关，提示HMGB1与坏死性凋亡有关。也有研究得出重度脓毒症和感染性休克患者的RIPK3水平在不同时间点均显著高于脓毒症组，且与序贯器官衰竭评估评分和降钙素原水平呈正相关^[52]。Shashaty等^[53]还发现脓毒症患者血浆RIPK3从发病到48 h的变化与脓毒症的急性呼吸窘迫综合征有关，二次分析还表明，RIPK3与急性肾损伤和脓毒症患者30 d病死率有关。因此，RIPK3已被证明是临床上预测脓毒症预后的一个监测因子。另一项研究使用MLKL作为坏死性凋亡的标志物，发现尽管血清水平差异无统计学意义，但脓毒症幸存者细胞内MLKL和RIPK3的表达明显高于健康对照组^[54]。由于这些研究的样本量小可能会对结果产生影响，因此还需要进行大样本量的临床研究来证实RIPK3和MLKL在脓毒症中的价值，并应探索更多可能与坏死性凋亡相关的生物标志物。

鉴于坏死性凋亡在脓毒症发病机制中的重要作用，干预坏死性凋亡相关蛋白的表达或活性可能在脓毒症的治疗中发挥作用。有多种药物被证明可以抑制坏死性凋亡，包括免疫抑制药物环孢素A^[55]，雷帕霉素^[56]，热休克蛋白90的抑制剂以及中药广藿香醇^[57]等。靶向抑制坏死性凋亡的翻译后修饰也是临床干预的一个途径，目前针对该途径的大部分研究都集中在RIPK1激酶上。例如利福尼通过抑制RIPK1的磷酸化抑制坏死体的形成，显著降低SIRS小鼠肺组织IL-6过度表达，从而对TNF-α诱导的全身炎症反应综合征有保护作用^[58]。针对坏死性凋亡关键分子的特异性抑制剂也正在开发中。Zhao等^[59]研究结果表明JQ1可以通过BRD4影响RIPK1去抑制坏死性凋亡，调控炎症和改善线粒体功能障碍来减轻单核细胞增多性李斯特菌引起的肝损伤。此外，临床上使用的抗惊厥药物苯妥英^[60]也可以抑制RIPK1的活性。然而，这些研究大多是基于体外实验或动物模型，因此这些化合物和药物临床应用的可行性还有待体内和临床试验的评估。

综上所述，坏死性凋亡作为一种重要的细胞死亡方式，参与了机体内环境平衡的维持。根据其在脓毒症发生发展过程中的作用研究，发现其不仅具有可以作为脓毒症疾病炎症程度的标志物的潜力，并且针对坏死性凋亡相关蛋白的干预可以改善脓毒症的预后。因此，加强对坏死性凋亡在脓毒症发病机制中的深入研究，将有助于改进脓毒症的治疗策略。

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