2025, Vol. 34
2. 宜昌市中心人民医院心血管内科，宜昌 443003;
3. 缺血性心血管病湖北省重点实验室，宜昌 443003;
4. 湖北省缺血性心血管疾病临床医学研究中心，宜昌 443003
2. Department of Cardiology, Yichang Central People's Hospital, Yichang 443003, China;
3. Hubei Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Yichang 443003, China;
4. HuBei Clinical Research Center for Ischemic Cardiovascular Disease, Yichang 443003, China
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是世界范围内致死率和致残率较高的急危重症心血管疾病，其发病率在中国近几十年呈显著上升趋势[1]。随着治疗技术的进步，使AMI患者早期有效地接受血运重建技术，可挽救部分缺血心肌，从而改善患者预后[2]。然而，在恢复血液再灌注的过程中可导致部分缺血心肌的损伤进一步加重，出现心律失常、心肌顿抑和微血管功能障碍等一系列病理事件，这一过程为心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI），导致再灌注治疗的临床净获益被严重削弱[3]。因此，深入探索MI/RI的病理机制并寻找减轻MI/RI的有效措施具有重要的临床意义。
MI/RI的病理生理机制涉及程序性细胞死亡、氧化应激、钙超载、免疫反应、炎症反应等[4]。其中氧化应激是MI/RI的重要发病机制之一。核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信号通路作为氧化应激反应中的关键信号通路，通过参与了炎症反应、氧化应激、程序性细胞死亡等过程，在MI/RI的发生发展过程中发挥重要作用[5]。因此，通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制氧化应激可能是减轻MI/RI的有效策略。
细胞FLICE样抑制蛋白（cellular FLICE-like inhibitory protein, cFLIP）是抑制caspase-8活性的一种天然蛋白，cFLIP包括一个长cFLIP亚型和两个短cFLIP亚型，分别命名为cFLIPL、cFLIPS和cFLIPR，在大多数生命过程中作为凋亡抑制因子发挥作用[6]。此外相关研究表明cFLIP在调节细胞自噬、程序性坏死、内质网应激以及氧化应激等病理生理过程中发挥重要作用[7-10]。然而，关于cFLIP是否对MI/RI中的氧化应激是否具有调控作用仍未有研究。本研究拟通过构建重组腺病毒过表达心肌细胞中cFLIP蛋白，研究cFLIP在大鼠MI/RI中的作用，并进一步探讨cFLIP对MI/RI诱导氧化应激的调节机制，为防治MI/RI寻找新的有效靶点。
1 材料与方法 1.1 构建cFLIP重组腺病毒本研究所用重组腺病毒载体cFLIPL（Ad-cFLIPL）和病毒对照组（Ad-NC）由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建和纯化。利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。对阳性克隆进行测序及结果分析获得高纯度的质粒，经HEK293细胞包装后，扩增、浓缩，从而获得一定滴度的Ad-cFLIPL[5]。
1.2 动物分组48只雄性无特定病原体级SD大鼠均在三峡大学实验动物中心购买，体重为180~200 g。所有动物实验根据“三峡大学实验动物护理和使用指南”进行，并经动物实验伦理委员会批准，批准号为2023060U。采用随机数字抽签法将SD大鼠随机分为以下4组：(1)假手术组（sham组）：开胸后只穿线，不结扎冠状动脉左前降支（left anterior descending, LAD）；(2)缺血-再灌注组（ischemia-reperfusion，I/R组）：开胸后结扎LAD 30 min，再灌注3 h；(3) I/R+Ad-NC组：预先3 d感染Ad-NC后，开胸后结扎LAD 30 min，再灌注3 h；(4) I/R+Ad-cFLIPL组：预先3 d感染Ad-cFLIPL后，开胸后结扎LAD 30 min，再灌注3 h。
1.3 腺病毒感染大鼠心肌组织使用电子天平对大鼠进行称重，按照1 mL/kg的标准腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，待大鼠麻醉后剃毛，充分暴露颈部和胸部，沿胸骨上缘和颈前正中线位置剪开皮肤，使用钝性弯镊逐层分离皮下组织暴露气管，行气管插管。沿胸部中线偏左侧剪开皮肤，逐层分离皮下肌肉组织并于4~5肋间打开胸腔，撕开心包膜，用胰岛素针在心前区及心尖部多点注射滴度为5×109 pfu的重组腺病毒悬液，注射完成后逐层缝合伤口。
1.4 I/R模型建立重组腺病毒转染3 d后，建立大鼠I/R模型。按照上述步骤再次麻醉、插管并打开胸腔暴露心脏，于心尖搏动最明显处剪开肋骨，轻柔挑起左心耳，找到肺动脉圆锥部与左心耳根部之间的LAD，于左心耳下缘约2 mm处进针用6-0丝线将凹槽乳胶管与LAD结扎，见心尖部由于缺血变白后快速关闭胸腔。连接小动物心电图机，见ST段抬高提示缺血成功，并记录缺血时间。缺血30 min后，于乳胶管凹槽处剪断丝线，取出乳胶管，再灌注3 h。收集心脏组织及血液标本[5]。
1.5 超声心动图评估大鼠心脏功能按动物实验分组经相应处理并构建I/R模型后，再次腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定于小动物解剖台上，采用M型高频超声探头，取大鼠的心脏长轴切面，通过计算机软件计算连续5个心动周期的平均值来评估左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）。
1.6 2, 3, 5- 氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5- Triphenyl tetrazolium chloride, TTC）染色检测心肌梗死面积再灌注结束后，再次麻醉大鼠并固定于解剖台上，沿原切口打开胸腔充分暴露心脏，取出完整心脏后于-20 ℃冰冻30 min。心脏冻硬后取出，使用刀片自心尖部沿着与左心室长轴垂直的方向均匀的将心脏切成1~2 mm的薄片。将心脏切片浸泡于1.5%的TTC（Sigma公司）溶液中，置于37℃的避光条件下孵育15 min。染色结束后，将心脏切片取出置于装有多聚甲醛的5 mL EP管中浸泡过夜。将心脏切片按大小顺序排列后，用数码相机进行拍照，白色区域为发生缺血并梗死的心肌组织，图片进一步经电脑软件（Image-Pro Plus）分析处理。
1.7 大鼠心肌组织HE染色再灌注结束后，取出心脏并固定于多聚甲醛中24 h。随后依次进行脱水、包埋、切片、脱蜡以及染色，最后将切片放在通风橱里晾干后，放在显微镜下拍照。
1.8 大鼠血清心肌酶的生化检测再灌注完成后，使用5 mL注射器从下腔静脉缓慢抽取3 mL静脉血液于采血管中，置于4 ℃冰箱中保存，将采集的血液标本用2 000 r/min离心15 min后收集上清液。使用全自动化分析仪（德国西门子）检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）和肌酸激酶同工酶（creatine Kinase-MB, CK-MB）水平。
1.9 大鼠血清氧化应激标志物检测称取100 mg大鼠心肌组织，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤后制备成组织匀浆液，将组织匀浆液用4 ℃低温离心机以3 500 r/min离心15 min，收集上清液。严格按照试剂盒（中国碧云天）使用说明书分别检测超氧化物酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GSH-px）以及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）。
1.10 大鼠心肌组织活性氧检测将心肌组织用PBS清洗后，立即进行冷冻切片。随后将浓度为10 µmol/L的DHE（Sigma公司）溶液均匀滴于组织切片上，避光条件下37 ℃孵育20 min后用PBS清洗2次，于共聚焦显微镜下拍照观察。
1.11 Western blot检测蛋白表达取心肌组织提取蛋白后，用紫外分光光度计检测各组蛋白浓度。按上清液体积按比例加入5×蛋白上样缓冲液后，在95 ℃金属锅中加热5 min，使蛋白变性。将配制好的10% SDS-PAGE凝胶固定于电泳槽中，设置恒压80 V的电压进行电泳，转膜仪设置恒流200 mA的湿转法将蛋白转膜至PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭3 h，加入一抗Nrf2（1∶1 000，三鹰公司）、HO-1（1∶1 000，三鹰公司）、LaminB1（1∶5 000，三鹰公司）、GAPDH（1∶5 000，三鹰公司）于4 ℃孵育过夜。次日回收一抗，TBST洗膜3次，在室温下条件下加入二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，将PVDF膜置入ECL显影液中，于显影仪中显像并保存图片，用Image J软件对条带进行蛋白定量分析。
1.12 统计学方法实验结果使用SPSS 25.0进行分析，所有计量数据均以均数±标准差（x±s）表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，组间的进一步两两比较使用最小显著性差异法（least significance difference, LSD）。采用GraphPad Prism 7软件绘制直方图，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 成功感染重组腺病毒至大鼠心肌组织重组腺病毒cFLIPL注射至大鼠心肌组织3 d后，分别取各组大鼠心肌组织进行切片，置于荧光显微镜下观察，结果显示sham组与I/R组心肌组织无绿色荧光，而I/R+Ad-NC组和I/R+Ad-cFLIPL组心肌组织绿色荧光表达明显（图 1A）。进一步使用Western blot检测各组大鼠心肌细胞间cFLIPL的蛋白表达，发现与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组可显著下调cFLIPL的表达，而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组显著上调了cFLIPL的表达（图 1B、C）。以上结果提示重组腺病毒cFLIPL已成功感染至大鼠心肌组织。
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| 注：A为荧光显微镜观察腺病毒感染心肌组织情况（×100）；B为各组大鼠心肌组织cFLIPL蛋白表达比较；C为以GAPDH为内参统计的cFLIPL的量化分析；与sham组相比，aP < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 1 重组腺病毒成功感染大鼠心肌组织 Fig 1 Successful infection of rat myocardial tissue with recombinant adenovirus |
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使用超声心动图评估I/R后大鼠心脏功能发现，与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组大鼠LVEF和LVFS值均显著降低（均P < 0.05），而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组LVEF和LVFS值均显著上升，差异具有统计学意义（图 2）。
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| 注：A为各组大鼠心脏超声心动图；B为各组大鼠LVEF的量化分析；C为各组大鼠LVFS的量化分析；与sham组相比，aP < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 2 各组大鼠心功能的比较 Fig 2 Comparison of cardiac function of rats in each group |
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使用TTC染色检测各组大鼠心肌梗死面积，其中正常心肌区域为红色，梗死区域为白色。与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组大鼠心肌梗死面积显著增加（均P < 0.05）。而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组心肌梗死面积显著降低（P < 0.05）。见图 3。
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| 注：A为各组心肌组织的TTC染色结果；B为TTC染色结果的量化分析；与sham组相比，aP < < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 3 各组大鼠心肌梗死面积的比较 Fig 3 Comparison of myocardial infarct size in each group of rats |
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使用HE染色评估各组心肌组织状态，如图 4A所示，sham组心肌细胞排列整齐，无心肌纤维断裂，I/R组和I/R+Ad-NC组心肌细胞排列紊乱，出现心肌细胞坏死、肿胀和心肌纤维断裂，而I/R+ Ad-cFLIPL组心肌细胞的损伤明显减轻。进一步检测各组血清心肌酶发现，与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组的LDH和CK-MB水平显著升高（均P < 0.05），而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组LDH和CK-MB水平显著降低（P < 0.05）（图 4B、C）。
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| 注：A为各组大鼠的HE染色结果；B为各组大鼠血清中LDH的量化分析；C为各组大鼠血清中CK-MB的量化分析；与sham组相比，aP < < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 4 各组大鼠心肌组织损伤形态及心肌损伤标志物的比较（×100） Fig 4 Comparison of myocardial tissue injury morphology and myocardial injury markers in each group (×100) |
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使用ELISA法检测氧化应激相关指标发现，与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组的SOD和GSH-Px活力显著降低，MDA浓度升高（均P < 0.05）。而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组SOD和GSH-Px活力显著升高，MDA浓度降低（均P < 0.05）（图 5A~C）。同时，使用DHE染色检测各组大鼠心肌组织ROS水平，与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组ROS阳性细胞比例显著增加（均P < 0.05），而与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组ROS阳性细胞比例显著降低（P < 0.05）（图 5D、E）。
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| 注：A为各组大鼠血清中SOD的量化分析；B为各组大鼠血清中GSH-Px的量化分析；C为各组大鼠血清中MDA的量化分析；D为各组心肌组织中ROS荧光强度的量化分析；E各组心肌组织中ROS染色的荧光图；与sham组相比，aP < < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 5 各组大鼠心肌组织氧化应激相关指标的比较（×100） Fig 5 Comparison of oxidative stress related indexes in myocardial tissue of rats in each group(×100) |
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使用Western blot检测氧化应激相关蛋白的表达变化，与sham组相比，I/R组和I/R+Ad-NC组的p-Nrf2、Nrf2和HO-1蛋白表达显著增加（P < 0.05），且与I/R+Ad-NC组相比，I/R+Ad-cFLIPL组p-Nrf2、Nrf2和HO-1的蛋白表达进一步增加（P < 0.05）。见图 6。
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| 注：A为各组大鼠心肌组织Nrf2和HO-1的蛋白表达比较；B以LaminB1为内参统计的Nrf的量化分析；C以GAPDH为内参统计的HO-1的量化分析；与sham组相比，aP < < 0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP < 0.05 图 6 各组大鼠心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达的比较 Fig 6 Comparison of protein expression of Nrf2 and HO-1 in myocardial tissue of rats in each group |
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MI/RI的发病机制十分复杂，包括钙超载、氧化应激、线粒体损伤、内质网应激、凋亡和自噬等[11]。课题组前期研究表明，过表达cFLIP可分别通过抑制心肌细胞凋亡、自噬、程序性坏死以及内质网应激，从而发挥心肌保护作用[7-10]。本研究中I/R组大鼠较sham组相比LVEF、LVFS值显著降低，血清心肌损伤标志物LDH、CK-MB含量显著升高，心肌梗死面积显著增加，而过表达cFLIPL后，LVEF、LVFS值升高，血清LDH、CK-MB含量显著降低，心肌梗死面积显著降低。过表达cFLIPL可以减轻I/R大鼠的心肌组织损伤，改善心功能并缩小心肌梗死面积，进一步证实cFLIPL是治疗MI/RI的潜在有效新靶点。并首次发现在大鼠MI/RI过程中过表达cFLIPL可显著抑制氧化应激，其部分机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路密切相关。
近年来，越来越多的证据表明氧化应激是导致MI/RI发生的主要病理机制[12]。一般来说，生理状态下活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生和抗氧化系统之间处于平衡状态，而当ROS过量产生，超过机体清除过氧化物的能力时，氧化还原平衡状态被破坏，导致氧化应激的发生[13]。SOD是抗氧化系统中最主要的抗氧化酶，能够清除细胞内产生的超氧自由基，反映细胞的抗氧化防御系统的功能状态[14]。GSH-px是在心肌细胞中广泛分布的一种谷胱甘肽过氧化物酶，可通过清除氧自由基和减少脂质过氧化物的形成，从而保护细胞免受氧化应激的损伤[15]。MDA是氧化应激过程中的中间产物，可以间接反映脂质过氧化程度，是临床中用来评估氧化应激程度的常用指标[16]。本研究结果显示，I/R组大鼠心肌组织较sham组相比，MDA和ROS水平显著增加，SOD和GSH-px的水平显著降低，而过表达cFLIPL后可降低MDA和ROS水平，并同时提高SOD和GSH-px水平。以上研究结果表明大鼠心肌组织I/R损伤引起氧化还原平衡系统紊乱，导致了氧化应激的发生。而过表达cFLIPL可通过提高抗氧化酶活性，清除过量ROS的产生，从而发挥心肌保护作用。然而过表达cFLIPL在大鼠MI/RI过程中抑制氧化应激的确切机制尚不清楚。
Nrf2/HO-1是机体抵抗氧化应激的重要信号通路，其中Nrf2在心脏中广泛表达，氧化应激发生时Nrf2-Keap1复合体解离，导致Nrf2基因被激活并转移至细胞核中进而增加下游抗氧化基因的表达。HO-1是Nrf2的主要下游靶基因之一，具有抗氧化损伤、调节细胞凋亡、减轻炎症的作用[17]。近年来，大量研究发现调节Nrf2/HO-1信号通路可以减轻MI/RI。例如，Huang等[18]研究发现巴多酮甲基可通过激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激和心肌细胞凋亡，从而改善MI/RI。与之一致的是，Ge等[19]研究证实梓醇通过激活Nrf2/HO-1通路抑制了MI/RI过程中的氧化应激和炎症，发挥了显著的心脏保护作用。因此，激活Nrf2/HO-1通路是减轻MI/RI的有效策略。此外，有研究表明卡铂和硫利达嗪联合治疗可通过蛋白酶体降解cFLIP蛋白的表达，从而调控依赖Nrf2的蛋白酶体亚基α5，最终诱导人头颈癌细胞调亡[20]。然而，CFLIPL是否可通过调控Nrf2/HO-1信号通路减轻MI/RI尚未被研究。本研究结果显示，大鼠心肌组织I/R组较sham组相比，Nrf2和HO-1的蛋白表达明显升高，而过表达cFLIPL后，Nrf2和HO-1的蛋白表达水平在I/R组的基础上进一步增加。以上研究结果表明大鼠心肌I/R后，机体自身发生防御反应激活Nrf2/HO-1信号通路发挥心肌保护作用，而过表达cFLIPL可进一步激活Nrf2/HO-1信号通路抑制氧化应激，从而减轻大鼠MI/RI。
综上所述，本研究证明了在MI/RI过程中cFLIPL的蛋白表达下调与氧化应激密切相关，过表达cFLIPL可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，提高抗氧化应激基因HO-1的表达抑制氧化应激，从而减轻大鼠MI/RI。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 周刚、李云曌：研究设计、实验操作、论文撰写；吴辉、刘滴：论文审阅及修改；张栋、杨青卓：数据整理；刘艳芳、李异：实验操作
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