2025, Vol. 34
脓毒症是感染导致宿主反应失调，进而发生危及生命的器官功能障碍，是一种极其严重的临床症候群[1]。脓毒症患者往往存在不同程度的凝血功能障碍，早期大多呈高凝状态，弥漫性微血管内血栓形成可导致微循环障碍，组织缺血缺氧，进而发生多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），因此凝血活化是脓毒症发展成MODS的始动因素[2]。
近年研究表明损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern, DAMP）在脓毒症凝血活化过程中起关键性作用，尤其是组蛋白作为一种重要的DAMP分子，受到广泛关注。组蛋白是所有真核生物都表达的结构性蛋白，正常情况下，细胞外组蛋白浓度很低，然而当发生细胞坏死和凋亡时，细胞外组蛋白浓度明显增高[3]，组蛋白是脓毒症发生和发展过程中的重要介质之一[4]。血管生成素（angiopoietin, Ang）是一类内皮特异性促血管新生因子家族。Ang与其受体酪氨酸激酶受体2（tyrosine kinase receptor 2, Tie2）结合，在调节血管稳态、血管生成以及炎症反应中发挥重要作用[5]。普通肝素（unfractionated heparin, UFH）不仅有抗凝作用，还可以通过降低血管通透性、保护内皮细胞以及减轻炎症反应等对机体发挥保护作用[6]，但具体作用机制仍未十分清楚。因此，本研究的目的在于探讨组蛋白对凝血功能的影响以及Ang/Tie2信号轴的参与，并深入研究UFH的保护作用及其机制，为脓毒症治疗提供更科学的理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物选用24只8~12周龄的雄性C57BL/6小鼠，按照12 h昼夜节律，予以正常饮食适应性喂养3~7 d。小鼠均采购于长生生物技术有限公司，饲养于动物中心，符合国际动物伦理道德准则和行为规范，经伦理委员会批准（伦理审批号：2022-57-2），并遵守动物饲养规定。
1.2 实验材料组蛋白购自德国Merck公司；免疫组化试剂盒购自中国福建福州迈新生物技术开发有限公司；ELISA试剂盒均购自中国上海酶联生物科技有限公司；PCR引物购自中国武汉赛维尔科技有限公司；Steady pure通用型RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂预混液、荧光定量qPCR试剂盒均购自中国湖南艾科瑞生物工程有限公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA定量试剂盒均采购于中国上海碧云天生物技术股份有限公司；配胶试剂盒购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司；Marker购自北京兰杰柯科技有限公司旗下品牌biosharp；PVDF膜购自德国Merck公司；兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司；山羊抗Ang-1抗体购自美国R & DSystem公司；兔抗Ang-2抗体、兔抗pTie2抗体、兔抗纤维蛋白原（fibrinogen, FIB）抗体、兔抗组织因子（tissue factor, TF）抗体均购自美国Abcam公司；HRP山羊抗兔二抗购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司。实验仪器包括数字切片扫描仪（中国山东志盈医学科技有限公司），酶标仪（美国BioTeck公司），逆转录仪、荧光定量PCR仪（美国Thermo Scientific公司），化学发光成像仪（中国上海天能科技有限公司）。
1.3 分组及干预措施24只小鼠按随机数字法分为对照组（Control组）、组蛋白组（Histone组）、组蛋白+UFH组（Histone+UFH组），每组8只，Histone组及Histone+UFH组均予以尾静脉注射组蛋白50 mg/kg，1 h后Histone+UFH组再予以尾静脉注射UFH 400 U/kg，Control组均予等体积生理盐水。组蛋白及UFH的给药剂量参照文献调研及先前研究结果[7-8]。造模4 h后取材，采用2%异氟烷深度麻醉，消毒后逐层开腹，剪开膈肌暴露心脏下缘，心尖穿刺收集血液样本，血液离心后取血浆用于ELISA。采用心脏灌流后取肺组织。
1.4 肺组织病理学观察新鲜肺组织于4%多聚甲醛固定24 h，经脱水、透明、浸蜡和包埋制成石蜡块，石蜡切片制成3 μm切片，行HE染色，予中性树胶封片。光镜下观察急性肺损伤的严重程度，并根据Smith评分准则进行评分[9]。
1.5 肺湿干比及肺水含量百分比取新鲜肺组织，称量肺叶重量即为湿重，将其烘干72 h后肺叶重量即为干重。计算肺湿/干比及肺水含量百分比评价肺水肿的严重程度：湿/干=湿重/干重；肺水含量百分比=（湿重–干重）/湿重×100%。
1.6 免疫组织化学将石蜡切片制成5 μm切片，经脱蜡、水化、抗原修复、50 μL 10%山羊血清常温封闭，加入兔抗FIB抗体（以1∶4 000稀释）孵育过夜。TBST清洗3次后再加入生物素标记的羊抗小鼠/兔二抗原液室温孵育20 min，DAB显色、复染细胞核、脱水透明，最后镜下观察肺FIB的表达情况。
1.7 ELISA检测将小鼠血液置于4 ℃离心机下3 000 r/min离心20 min，收集上清液，实验按照ELISA试剂盒指示操作，使用酶标仪在450 mm波长处读取各孔OD值，根据标准曲线计算样品在血浆中的浓度。
1.8 qRT-PCR检测按照Trizol试剂盒说明书提取RNA，进行RNA纯度鉴定，按反转录试剂说明书将所提RNA反转录成cDNA。运用PCR扩增仪进行qRT-PCR反应，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退热60 ℃30s循环40次，最终得到各孔的CT值，用2-ΔΔCT计算mRNA的相对表达量。选用GAPDH作为内参，引物设计由武汉赛维尔科技有限公司完成，引物序列见表 1。
| 指标 | 引物序列 |
| GAPDH | 正向：5’- GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’ |
| 反向：5’- TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’ | |
| TF | 正向：5’- TACCTTACCGAGACACAAACCT-3’ |
| 反向：5’- CTTTCCCGTGCTTGAGCCTT-3’ | |
| FIB | 正向：5’- GTACGTGGCCCAACAGTTGT-3’ |
| 反向：5’- AAGGGCATTTGTGGTTCCAGT-3’ | |
| PAI-1 | 正向：5’- GGCCTCCAAAGACCGGAAT-3’ |
| 反向：5’- ACAAAGATGGCATCCGCAGTA-3’ | |
| Ang-1 | 正向：5’- GAAGATGGAAGCCTGGATT-3’ |
| 反向：5’- TACTGCCTCTGACTGGTTA-3’ | |
| Tie2 | 正向：5’- AATGGCTCCTTCATCCACTCAG-3’ |
| 反向：5’- GCTTCACATCTCCGAACAATCA-3’ | |
| Ang-2 | 正向：5’- CAACAACTCGCTCCTTCA-3’ |
| 反向：5’- CCACACTGCCATCTTCTC-3’ | |
| 注：GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，TF为组织因子，FIB为纤维蛋白原，PAI-1为纤溶酶原激活物抑制剂-1，Ang为血管生成素，Tie2为酪氨酸激酶受体2 | |
使用RIPA裂解液分解组织获组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白加热变性后，将等量的蛋白加到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，恒压使蛋白电泳分离。恒流将胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinyl-idene fluoride, PVDF）膜上，室温下用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入Ⅰ抗（以1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗（以1∶500稀释）室温孵育2 h。再次TBST洗膜后，ECL化学液显示PVDF膜上的蛋白带。使用Image J软件分析蛋白表达量。
1.10 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行数据的统计学分析。所有的数据均需符合正态分布，通过均数±标准差（x±s）进行结果描述。采用单因素方差分析进行单因素多组样本比较，并进一步使用LSD-t检验进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 UFH对组蛋白诱导的肺损伤的影响为评价小鼠肺损伤程度，HE染色后光镜下观察肺组织病理生理学改变：Control组肺泡结构清晰完整，无炎症细胞浸润，无充血和水肿；Histone组肺泡大小不一、结构紊乱，肺泡内充血、水肿，肺泡壁增厚，肺泡内见纤维蛋白沉积，与对照组相比，肺组织病理学评分显著升高（P＜0.001）；Histone+UFH组结构完整，肺泡壁少量炎性细胞浸润，局部肺泡间隔增厚，与组蛋白组相比，肺组织病理学评分显著降低（P＜0.001）（图 1）。HE染色结果提示组蛋白能导致小鼠发生明显的急性肺损伤，而UFH能有效减轻组蛋白造成的肺损伤。
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| 注：A为各组HE染色结果图，黑色箭头为肺泡壁炎性细胞浸润，红色箭头为纤维蛋白沉积；B为病理学评分比较；每组n=8，Histone组与Control组相比，aP＜0.001；Histone组与Histone+UFH组相比，bP＜0.001 图 1 各组肺组织病理学改变及病理学评分 Fig 1 Pathological changes and pathological scores of lung tissues in each group |
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为检测肺水肿程度，称量肺湿重及干重并计算湿重/干重及肺水含量百分比，结果提示，Histone组肺的湿重/干重及肺水含量百分比较Control组明显增高[湿重/干重：(6.95±0.41) vs. (4.08±0.51)，P＜0.001]，证明组蛋白导致小鼠发生肺水肿；而Histone+UFH组肺的湿重/干重及肺水含量百分比较Histone组有所下降[湿重/干重：(5.00±0.15) vs. (6.95±0.41)，P＜0.01]，说明UFH减轻肺水肿严重程度。见图 2。
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| 注：A为各组肺湿重/干重；B为各组肺水含量百分比；每组n=8，Histone组与Control组相比，aP＜0.001；Histone组与Histone+UFH组相比，bP＜0.01 图 2 各组小鼠肺湿重/干重及肺水含量比较 Fig 2 Comparison of lung wet weight/dry weight ratios and lung water content among groups of mice |
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采用免疫组织化学测量肺组织FIB的表达情况，Histone组见血管内血栓形成，肺泡及微血管内见褐色纤维蛋白原沉积，UFH干预后纤维蛋白原表达减少，无血栓形成，这说明UFH减轻组蛋白造成的凝血活化。见图 3。
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| 注：各组免疫组化染色结果图，黑色箭头为纤维蛋白原沉积 图 3 各组纤维蛋白原表达 Fig 3 Expression of pulmonary fibrinogen in mice in each group |
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TAT反应体内凝血酶的生成，PAI-1及D-D反应纤溶情况。测量小鼠血浆TAT、PAI-1、D-D表达水平，结果提示，与Control组比较，Histone组小鼠血浆中TAT、PAI-1、D-D表达水平明显升高[(23.48±3.97) pg/mL vs. (51.98±5.52) pg/mL，(68.75±3.68) pg/mL vs. (118.50±11.23) pg/mL，(775.30±314.80) pg/mL vs. (1 179.00±149.70) pg/mL；均P＜0.001]，证明组蛋白诱导凝血活化，纤溶发生抑制。而Histone+UFH组与Histone组比较，小鼠血浆中TAT、PAI-1、D-D表达水平有所下降[(38.20±8.23) pg/mL vs. (51.98±5.52) pg/mL，(90.15±8.08) pg/mL vs. (118.50±11.23) pg/mL，(892.20±63.91) pg/mL vs. (1 179.00±149.70) pg/mL；均P＜0.05]，见图 4，说明UFH减轻组蛋白诱导的凝血活化。
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| 注：A为TAT血浆浓度；B为PAI-1血浆浓度；C为D-D血浆浓度；每组n=8，Histone组与Control组相比，aP＜0.001；Histone组与Histone+UFH组相比，bP＜0.05 图 4 小鼠血浆TAT、PAI-1、D-D浓度 Fig 4 Concentrations of TAT, PAI-1, and D-D in the plasma of mice in each group |
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上述研究已经证实组蛋白可以造成肺组织急性肺损伤、凝血活化，为进一步证实组蛋白对肺组织凝血活化影响的机制，通过qRT-PCR检测小鼠肺组织各指标的mRNA表达水平。结果显示，与Control组比较，Histone组TF、FIB、PAI-1的mRNA表达水平较高[(1.00±0.01) vs. (11.61±0.24)，(1.01±0.18) vs. (77.14±13.69)，(1.00±0.11) vs. (48.98±1.81)；均P＜0.0001]，UFH治疗后TF、FIB、PAI-1的mRNA表达水平明显下降，[(3.01±0.09) vs. (11.61±0.24)，(32.41±3.19) vs. (77.14±13.69)，(35.57±4.00) vs. (48.98±1.81)，均P＜0.01]，见图 5A~C，进一步说明了组蛋白造成了小鼠肺组织的凝血活化，UFH有效缓解这种改变。与Control组比较，Histone组Ang-1、Tie2的mRNA表达水平明显下降[(1.00±0.04) vs. (0.09±0.01)，(1.17±0.04) vs. (0.22±0.02)，均P＜0.001]，见图 5D~E，Ang-2的mRNA表达水平升高[(1±0.04) vs. (1.61±0.05)，P＜0.001]，见图 5F，而UFH减少组蛋白导致的各指标表达的影响，说明组蛋白诱导的凝血活化可能与Ang/Tie2信号通路相关，而UFH对小鼠的保护作用可能是通过Ang/Tie2信号轴实现的。
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| 注：每组n=8，Histone组与Control组相比，aP＜0.001；Histone组与Histone+UFH组相比，bP＜0.01 图 5 小鼠肺组织各指标mRNA相对表达量 Fig 5 Relative mRNA expression levels of each parameterin the lung tissues of mice in each group |
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为进一证实组蛋白对小鼠凝血功能的影响及作用机制，采用Western blot检测肺组织TF、FIB、Ang-1、Ang-2、pTie2蛋白表达水平。与Control组比较，Histone组肺组织TF、FIB、Ang-2的蛋白表达水平增加[(0.44±0.10) vs. (0.86±0.08)，1 vs. (3.56±0.57)，1 vs. (1.53±0.07)，均P＜0.01]，见图 6 A~C。而Ang-1、pTie2的蛋白表达水平明显减少[1 vs. (0.41±0.15)，1 vs. (0.52±0.14)，均P＜0.01]，见图 6 D~E，UFH有效减轻这种改变，与mRNA的表达水平变化一致，进一步说明组蛋白诱导的凝血活化可能跟与Ang/Tie2信号通路相关，而UFH对小鼠的保护作用可能是通过Ang/Tie2信号轴实现的。
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| 注：n=8，Histone组与Control组相比，aP＜0.01；Histone组与Histone + UFH组相比，bP＜0.05 图 6 各指标的蛋白条带及蛋白相对表达量 Fig 6 Protein bands and relative expression levels of each parameter |
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基于组蛋白是脓毒症的发生和发展的重要介质之一[4, 10-11]，本实验通过尾静脉注射组蛋白，发现组蛋白造成小鼠急性肺损伤及凝血活化，而UFH能有效缓解这种改变。同时，组蛋白还影响Ang及Tie2 mRNA及蛋白表达，提示组蛋白可能通过Ang/Tie2通路发挥毒性作用，UFH可能通过Ang/Tie2信号轴减轻组蛋白造成的肺损伤和凝血活化。
脓毒症患者往往存在不同程度的凝血功能障碍，严重时进展为DIC，弥漫性微血管内血栓形成可导致微循环障碍，组织缺血缺氧，进而发生MODS[2]。越来越多的证据表明，细胞外组蛋白与凝血的发生有着密切的联系[12-14]。循环H3水平与脓毒症患者的病死率相关、与抗凝血酶水平呈负相关[15]；H3是确定脓毒症患者高死亡风险凝血障碍的潜在标志物[16]。本实验通过小鼠尾静脉注射组蛋白，结果显示组蛋白造成小鼠肺损伤，表现为肺水肿、炎性细胞浸润、肺泡结构破坏。此外，免疫组织化学结果发现，Histone组肺泡内及微血管内FIB的表达增高，部分血管出现内皮下纤维蛋白原沉积、管腔内有血栓形成。同时，ELISA、qRT-PCR、Western blot显示血浆和组织中凝血标志物水平升高，均证明组蛋白诱导小鼠凝血活化、血栓形成。而Histone+UFH组，组蛋白诱导的改变明显改善，说明UFH可以减轻组蛋白诱导的肺损伤和凝血活化。
内皮细胞的功能障碍是脓毒症发生DIC的重要机制。Ang/Tie2作为稳定新生内皮血管的信号轴，参与调节内皮细胞功能，其信号轴标志物的变化是脓毒症凝血功能障碍的发生的早期事件[17]。Ang是Tie2的配体，Ang-1与Tie2受体结合使其发生磷酸化，血管处于静止状态[18]。机体感染时，从内皮细胞储存的Ang-2可以竞争性地抑制Ang-1与Tie2的结合，使Tie2受体处于去磷酸化状态，并扰乱内皮细胞的稳定[19-20]。在LPS造模的脓毒症小鼠中，Ang-1可以使内皮细胞处于静止状态，从而减轻脓毒症诱导的急性肺损伤[21]；Ang-2在COVID-19相关高凝状态中起着重要作用，Ang-2抑制剂可能有效缓解严重COVID-19感染导致的高凝状态[22]。本实验结果显示，组蛋白诱导Ang/Tie2轴的改变，表现为组蛋白组Ang-2的mRNA和蛋白表达水平升高，而维持内皮稳定因子Ang-1和pTie2的表达有所减少，这表明组蛋白可能通过影响Ang/Tie2通路，破坏内皮细胞的完整性使得血管通透性增加，促进凝血活化和血栓形成。
UFH作为一种抗凝剂在临床上广泛应用。研究发现UFH除了有抗凝作用外，还可以通过与肝素结合蛋白结合、作用于NF-κB、参与选择素介导的粘附反应等发挥抗炎作用[23]。本实验采用组蛋白造模后1 h，再予以UFH治疗，相比于既往实验方式来看，更符合临床实际。结果显示，UFH有效减轻组蛋白造成的肺损伤和凝血活化，同时UFH减轻组蛋白造成的Ang-1、pTie2 mRNA和蛋白表达水平下调和Ang-2 mRNA和蛋白表达水平上调。提示UFH对组蛋白造成的毒性作用具有保护作用，这种保护作用可能是通过Ang/Tie2通路发挥的作用。
本研究仍存在一定的局限性：首先，UFH减轻组蛋白的毒性作用及Ang/Tie2通路的参与，没有加用抑制剂或激动剂干扰进一步证实；其次，Ang/Tie2通路对血管内皮细胞功能的调节作用，以及组蛋白活化凝血后对其他器官功能的影响，仍需后续进一步深入研究。
综上所述，本实验证明了组蛋白造成小鼠肺损伤、肺水肿和凝血活化，UFH可能通过Ang/Tie2信号轴减轻组蛋白造成的肺损伤和凝血活化。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 刘丹燕：实验设计、实验操作、数据分析、论文撰写；迟雅文：研究设计、论文修改；迟雅文、尹佳：实验操作、数据收集及整理；李旭：实验设计、论文修改、支持性贡献
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