脓毒症是由感染诱导的免疫失衡反应所致的临床综合征，具有发病急、病情重、病死率高等特点，是当前急诊与重症医学领域的重点研究方向之一^[1-2]。其发生发展过程中，免疫系统的过度激活或免疫抑制常导致持续炎症反应、多器官功能障碍及不良结局。免疫细胞的动态变化、功能状态及其相互作用构成脓毒症发病机制的重要基础。传统研究多基于群体细胞平均信号，难以揭示细胞亚群间的功能差异及细胞间通讯。单细胞测序技术（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）作为一种新兴的高通量技术，具备高分辨率和高敏感度优势，可从单细胞水平解析细胞类型、基因表达特征及免疫调控机制，已广泛应用于肿瘤、感染、免疫等疾病的研究中^[3]。近年来，该技术在脓毒症研究中也逐渐得到重视，在病原体识别、免疫微环境描绘、关键调控因子筛选等方面取得了一系列进展。本文将围绕scRNA-seq在脓毒症研究中的应用现状，重点综述其在感染因子识别、免疫反应调控机制解析及预后预测等方面的研究成果，为脓毒症精准诊治提供理论支持和科研参考。

1 scRNA-seq的概述和发展

传统测序技术通常基于整体细胞群体的平均信号进行分析，主要在组织或器官的总体水平获取信息，因而无法区分单个细胞的异质性变化，容易忽略某些重要信号的微小差异。相比之下，scRNA-seq以单个细胞为独立遗传单位，深入研究细胞的异质性与复杂性^[4]。过去十余年间，随着技术的飞速发展，scRNA-seq已能够对成千上万乃至数百万个细胞的转录组进行高通量测定，并实现对每个细胞的精确分类和鉴定，从而识别出罕见但功能重要的细胞群体^[5]。例如，在肿瘤学领域，scRNA-seq不仅揭示了肿瘤发生发展过程中的细胞异质性，还细化了肿瘤细胞的分型及遗传谱系，有助于指导精准治疗策略的制定与患者预后评估，显著提升临床治疗效果和患者生活质量^[6]。

1.1 单细胞获取与分离

单细胞的获取方法因样本来源和细胞特性而异，可分离单个细胞、细胞核、细胞器或特定表面标志的靶细胞。常用方法包括显微操作法、有限稀释法、流式细胞分选法、激光捕获显微切割法及微流控芯片法。显微操作法借助显微工具在视野下挑选单细胞，适用于如胚胎或造血干细胞等稀有细胞。有限稀释法通过连续稀释获得单细胞，方法简便、成本低。流式细胞分选基于标志物或光学特性高通量分选单细胞，准确性高、适于标准化实验^[7]。激光切割法可从组织切片中精准获取特定细胞群，细胞完整性好，但依赖设备精度。微流控芯片技术通过微通道操控实现高效分离，适合大规模样本处理，但对技术要求较高^[4]。

1.2 scRNA-seq 1.2.1 单细胞全基因组测序技术

转录组指特定细胞在某一时间点转录产生的全部RNA分子，包括编码RNA和非编码RNA。通过测定转录组，可以全面揭示细胞的基因表达状态及调控机制，更好地反映细胞异质性。单细胞转录组测序主要用于研究胚胎发育、细胞分化等动态过程中的基因表达变化。其主要流程包括：(1)单细胞的捕获与分离；(2)RNA提取、逆转录及扩增；(3)标记并构建测序文库；(4)利用二代测序平台进行高通量测序；(5)对测序数据进行质量评估与生物信息学分析^[6-7]。

1.2.2 单细胞转录组测序技术

转录组是在某个阶段由细胞转录的全部RNA，可分为RNA和非编码RNA。因此通过测量分析转录组可以更为全面了解细胞的基因表达和调控，也更能反映细胞的异质性。主要是研究胚胎发育、分化等过程中等的动态突变基因。单细胞转录组测序主要包括：(1)捕获分离出单个细胞；(2)提取、逆转录并扩增转录细胞的遗传信息；(3)标记并构建测序文库；(4)利用第二代测序仪进行高通量测序。(5)对测序数据进行评估和分析^[6-7]。

1.2.3 表观基因测序

表观基因组测序通过研究DNA和染色质的化学修饰，揭示基因表达受环境因素、生活方式等非遗传因素调控的机制，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质重塑及基因印记等内容^[6]。其中，DNA碱基的修饰（如5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶等）是研究的重点。单细胞甲基化测序技术可在全基因组范围内实现对单细胞遗传调控状态的高分辨率解析，为理解细胞功能调控和疾病发生提供了重要工具。

1.2.4 单细胞蛋白组学测序

单细胞蛋白组学是在单细胞层面研究蛋白表达和翻译后修饰（PTMs）的前沿技术，能揭示细胞功能状态、表型异质性及其在微环境中的动态变化^[8]。相比传统蛋白组学，该技术克服了群体平均掩盖个体差异的局限，精准识别关键细胞亚群。当前主要依赖高灵敏度质谱方法（如SCoPE-MS、SCoPE2）及质谱流式细胞术，可定量分析数千种蛋白及其磷酸化、乙酰化、泛素化等PTMs^[9]。此外，与单细胞转录组联合分析可描绘细胞状态变化全景图，识别疾病进展的关键驱动因子^[10]。在肿瘤免疫微环境研究中，该技术助力解析免疫细胞功能、药物反应及耐药机制，为靶点筛选与疗效评估提供依据。综上，单细胞蛋白组学正成为精准医学领域解析疾病机制与发现新型治疗靶点的重要工具^[6]。

2 scRNA-seq与病原菌 2.1 细菌感染

scRNA-seq揭示了即便在基因背景相同的细菌中也广泛存在表型异质性。研究表明在尿路感染大肠杆菌中进一步发现其生物膜结构中存在不同亚群，伴随呼吸链复合物表达差异，提示功能分化^[11-12]。有研究指出，肠球菌中鞭毛基因表达的异质性与环丙沙星耐药性相关联^[13]。进一步研究显示，大肠杆菌和肠球菌中均可激活SOS反应，支持同一基因型细菌在不同环境下表现出表型可塑性^[14]。在肠球菌感染小鼠模型中，Ⅲ型分泌系统呈现开关状态，被认为与一种“自毁式合作”机制相关^[15]。此外，有研究表明致病性持久菌可通过抗生素耐受性引发感染复发，而单细胞水平的分离分析有助于揭示其转录调控策略^[16-17]。有研究开发了Microbe-seq（一种微流控液滴高通量单细胞测序平台），实现了菌株级分辨率，在肠道微生物中获得近20 000个单细胞扩增基因组，重建了丰富的细菌基因组及其水平基因转移网络，发现同门内细菌间的基因转移频率高于跨门转移，为抗药性传播机制提供了新见解^[18]。基于SAG-gel技术的研究进一步对未培养菌株进行了功能注释，发现种内代谢与侵袭功能存在明显异质性^[19-20]。此外，PMA-SAG-gel技术也被应用于肠道活菌的单细胞测序，鉴定出拟杆菌科耐氧菌的辅助基因与移动遗传元件，深化了对细菌在物种与菌株层面的生存策略理解，并为新型抗菌药物的研发提供了潜在靶点^[21]。

在宿主层面，研究发现革兰阴性菌感染可引起脓毒症患者外周单核细胞中JAK2STAT信号通路的表达与甲基化改变，调控免疫耐受基因表达，提示其为潜在炎症调节靶点^[22]。鲍曼不动杆菌（A. baumannii）作为多重耐药医院内致病菌，单细胞测序显示其可诱导THP1巨噬细胞极化并激活细胞铁死亡通路，导致宿主铁稳态紊乱。Ferrostatin1（Fer1）可通过抑制铁死亡机制改善宿主细胞活力，增强抗感染能力，提示其作为辅助治疗策略的潜力^[23]。

此外，scRNAseq分析克雷伯菌脓毒症患者急性期与恢复期外周血单个核细胞发现，感染急性期CD4⁺ T细胞功能受抑，颗粒酶介导的NK细胞细胞毒活性下降，而CD8⁺ T细胞则维持细胞毒性表型，揭示淋巴细胞亚群在感染进程中的动态功能变化^[24]。

综上，scRNA-seq为细菌表型异质性、抗药机制和宿主免疫反应的深入解析提供了关键工具，有助于实现脓毒症病原的精准识别和个体化抗菌治疗，避免抗生素滥用并提升临床干预效果。

2.2 病毒感染

病毒是依赖宿主细胞复制的细胞内寄生体，其感染过程呈现高度异质性，影响脓毒症的发病机制与流行特征。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可同步解析病毒与宿主的转录组，揭示感染与未感染细胞的差异、免疫应答及细胞间通讯，克服传统方法在识别细胞异质性方面的局限，已广泛应用于HSV、登革热、流感、HIV、HBV、SARS-CoV-2等多种病毒研究^[25]。有研究利用scRNA-seq分析COVID-19患者外周血单核细胞（PBMC），绘制了重症ARDS患者的免疫图谱，发现其外周免疫细胞存在干扰素刺激基因的异质性表达、HLA-Ⅱ下调及新型浆母细胞样中性粒细胞增多等特征，且炎症因子表达水平相对较低^[26]。另有研究比较H5N1与H9N2感染鸡肺的scRNA-seq数据，结果显示H5N1可激活多种细胞亚群的免疫反应，其中炎性巨噬细胞（簇0/1/14）高表达IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8，并通过CCL4、CCL19、CXCL13等趋化因子介导免疫细胞间互作，从而导致更严重的肺组织损伤^[27]。

此外，登革热病毒（DENV）感染的scRNA-seq研究发现，抗病毒IFN应答基因在多种免疫细胞中上调，表现出对同一病毒的异质性反应；DENV RNA主要富集于IgM⁺及部分幼稚B细胞中，突显viscRNA-seq在解析病毒-宿主互作中的优势^[28]。

综上，scRNA-seq在多种病毒感染、疫苗应答及脓毒症等复杂炎症状态中，均展现出解析病毒发病机制与免疫动态的潜力。持续的scRNA-seq研究与数据共享将有助于推动抗病毒干预策略创新，提升对新发病毒及病毒性脓毒症的防控能力^[25]。

2.3 免疫细胞

在脓毒症的发生发展中，各类免疫细胞发挥关键作用。scRNA-seq可实现转录组的高分辨率分析和精细的免疫细胞亚群划分。有研究利用scRNA-seq系统性评估了正常与脓毒症条件下中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞的分布及表型特征，识别出各类免疫细胞特异性激活的信号通路：中性粒细胞中炎症通路（如NF-κB）、病原相关分子模式（PAMPs）响应、细胞因子和缺氧应答显著激活；巨噬细胞则富集细胞衰老与炎症相关通路；B细胞激活内质网应激反应；T细胞则主要活跃于炎症、肺损伤及PAMPs相关信号通路中^[29]。另有研究发现，脓毒症患者中性粒细胞数量虽增多，但代谢活性下降、寿命延长，并与其他免疫细胞间存在复杂互作；其迁移能力受损导致血管内滞留，增强局部炎症反应^[30]。中性粒细胞可通过吞噬、脱颗粒和释放胞外成分形成胞外诱捕网（NETs）以捕获病原体，其中一氧化氮（NO）为关键效应分子，为靶向NETs提供了潜在干预策略^[31]。研究还揭示，单核细胞可通过RETN–CAP1信号轴介导抵抗素通路，参与脓毒症相关免疫失衡，CAP1的异常表达亦可能成为潜在生物标志物^[32]。此外，有研究发现脓毒症诱导的单核细胞群体高度异质，其中一类亚群呈S100A家族基因高表达与HLA-DR低表达，其抑制有望缓解免疫抑制状态，为治疗提供新方向^[33]。在脓毒症相关心肌病中，巨噬细胞通过整合素M与细胞间粘附分子-1（ICAM-1）介导免疫细胞动员，脂多糖（LPS）刺激可诱导其表达并参与心肌损伤过程^[34]。进一步研究鉴定了GSTO1、C1QA、RETN和GRN等核心基因主要在巨噬细胞中表达，提示其作为新型诊断与治疗靶点的潜力^[35]。针对Omicron感染，也有研究通过scRNA-seq分析重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液，发现肺泡环境呈现显著髓样炎症特征，ISG15⁺中性粒细胞与CXCL10⁺巨噬细胞均高表达干扰素刺激基因（ISGs），其中前者与保护性肺泡细胞增多及免疫耗竭相关，后者则促进抗体产生^[36]。在金黄色葡萄球菌诱导的脓毒症动物模型中，肾脏细菌负荷与Th17细胞浸润密切相关，Th17细胞经T-bet介导向Th1样细胞转分化，增强抗菌效应，该过程对清除感染至关重要^[37]。然而，其双刃剑效应提示，在脓毒症治疗中需精准调控Th17细胞的可塑性，兼顾免疫清除与炎症控制。

2.4 真菌

真菌性脓毒症在感染性休克中致死率较高，约60%的患者可进展为肾上腺功能不全，显著增加死亡风险。尤其由白色念珠菌等条件致病菌引起的侵袭性真菌感染，常诱发持续的系统性炎症反应，导致多器官功能障碍^[38]。有研究基于白色念珠菌感染小鼠模型并结合scRNA-seq技术，识别出肾上腺中17种不同的细胞类型，涵盖皮质、髓质、内皮、免疫及基质细胞，发现感染可显著重塑各类细胞的比例与功能状态。进一步分析显示，免疫细胞与肾上腺细胞之间的信号通讯增强，提示真菌感染可扰乱肾上腺微环境稳态，从单细胞层面揭示其潜在的内分泌紊乱机制^[39]。此外，scRNA-seq也为新冠相关肺曲霉病（COVID-19-associated pulmonary aspergillosis, CAPA）的发病机制研究提供了新见解。有研究对CAPA患者支气管肺泡灌洗液进行分析，发现其中性粒细胞比例显著低于COVID-19对照组，且呈现混合成熟轨迹及抗原呈递功能增强的特征，提示存在与真菌感染相关的功能重编程^[40]。同时，CAPA患者表现出Th1/Th17分化减少、不变T细胞耗竭以及单核/巨噬细胞中抗真菌信号通路的转录缺陷，整体形成免疫失衡状态。尽管NETs水平升高在一定程度上可解释中性粒细胞数量减少，但其进一步降低与90d病死率升高显著相关，提示NETs在CAPA中可能具有潜在的预后价值。综上，scRNA-seq技术在真菌性脓毒症研究中展现出重要应用价值，可高分辨率解析宿主-病原相互作用，识别关键免疫通路异常，并辅助发现诊断及预后生物标志物，为个体化抗真菌治疗提供理论依据与技术支撑。

2.5 程序性死亡

程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）在脓毒症的发生发展中至关重要，具有潜在诊断和预后价值。有研究利用单细胞测序筛选出与PCD相关的基因NLRC4、TXN和S100A9，作为脓毒症诊断的潜在生物标志物。这些基因主要在髓样细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，且与免疫细胞浸润密切相关^[41]。凋亡作为经典的PCD形式，被证实参与脓毒症的发病机制。有研究发现，Bcl2、FASLG、IRF9和JAK3是其中的关键调控基因，其相关差异表达基因亦具备一定的诊断价值^[42]。另有研究报道，S100A8/A9高表达可通过下调NRF1抑制线粒体复合物Ⅰ亚基NDUFA3，且scRNA-seq结果显示S100A8/A9^HI中性粒细胞与内皮细胞损伤密切相关，其中S100A8被认为是脓毒症患者预后不良的独立风险因子^[43]。

焦亡是一种炎症相关的非典型PCD，经典途径由小鼠caspase-1介导，非典型途径则依赖caspase-11（人类对应caspase-4/5）^[44-45]。通过激活孔蛋白GSDMD穿孔细胞膜，引发巨噬细胞焦亡，推动脓毒症进展。焦亡相关基因（PRGs）表达变化在脓毒症启动及多器官功能障碍中发挥关键作用^[46]。早期焦亡有助于抑制病原复制并加速清除^[47-48]，但caspase-11依赖非典型途径可导致内毒素性死亡和脓毒血症^[45]。Sun等^[49]通过单细胞测序鉴定10种PRGs的表达特征，发现脓毒症发展过程中免疫细胞代谢途径激活，PRGs表达整体升高，焦亡增加。特异性GSDMD^+巨噬细胞亚群仅见于存活患者，且随脓毒症进展增多，可能与预后相关，且与Tregs及CD4⁺、CD8⁺T细胞连接，提示焦亡与免疫调节密切相关。

近年来，铁死亡（ferroptosis）被证实在脓毒症发生和器官损伤中起重要作用。脓毒症患者常表现铁稳态紊乱，血清铁及铁蛋白升高，且与SOFA评分和病死率正相关^[50]。LPS诱导的内毒素血症模型显示心房组织铁死亡显著激活，铁转运蛋白下调，提示铁代谢异常与脓毒症相关房颤有关。LPS刺激引发PTGS2、MDA及脂质ROS升高，铁死亡抑制剂Fer-1可阻断该过程，并通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善心功能^[51-52]。在CLP模型中，小鼠肝脏GPX4和谷胱甘肽（GSH）水平下降，ROS、MDA及Fe²⁺升高，进一步证实铁死亡参与脓毒症器官损伤。鸢尾素（irisin）可通过抑制铁死亡改善线粒体功能和肝损伤，其在脓毒症患者中水平降低且与APACHEⅡ评分负相关，具有潜在保护作用^[53]。综上，铁死亡是脓毒症多器官功能障碍的重要机制，靶向铁死亡为治疗提供新策略。

2.6 预后

为更有效治疗脓毒症，亟需识别具备靶向潜力和预后预测能力的多靶点生物标志物^[54]。脓毒症发病过程中，线粒体超微结构损伤明显，包括肿胀、嵴丢失、基质破坏及膜破裂，同时伴随氧化应激、钙超载和功能抑制^[55]。线粒体作为细胞能量代谢、增殖和凋亡的关键调控者，是重要的治疗靶点^[56]。最新研究发现四个线粒体功能相关基因FIS1、FKBP8、GUK1和GLRX5在脓毒症患者中显著低表达，其表达水平与28 d生存率负相关，显示良好敏感性和特异性^[57-62]。单细胞转录组分析表明，这些基因主要在免疫细胞中表达，可能通过调控免疫反应参与脓毒症病理。具体而言，FIS1调节线粒体裂变及细胞凋亡，FKBP8维持蛋白折叠和线粒体稳态，GUK1参与免疫细胞鸟苷代谢，GLRX5维持铁稳态并影响免疫功能，均为潜在的线粒体靶向治疗候选。此外，TGFBI和MAD1L1与ROS诱导的单核细胞及B细胞衰老密切相关，提示其在脓毒症免疫衰老中的作用，可作为新型诊断和预后标志物^[63]。TGFBI编码富含RGD结构域的细胞外基质蛋白，参与细胞增殖、迁移及炎症调控^[64]；MAD1L1是纺锤体组装检查点核心，调节细胞周期进程^[65]。靶向调控这两基因或为免疫干预提供新思路。有研究报道，野生型p53诱导的磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase 1, WIP1）可通过调控p38 MAPK信号通路，减轻脓毒症相关急性肾损伤中的细胞焦亡，展现出潜在的治疗价值^[66]。

3 总结与展望

脓毒症仍是全球急危重症患者高死亡率的主要原因。尽管早期识别和干预能改善预后，但缺乏特异性强且临床可及的生物标志物，精准诊断与个体化治疗仍面临挑战。scRNA-seq的发展，为脓毒症的病原识别、免疫机制解析及治疗靶点筛选提供了高分辨率视角。本文综述了该技术在脓毒症中的应用进展，包括病原检测、免疫细胞亚群动态、基因表达、炎症调控及细胞间相互作用。研究显示免疫细胞高度异质，激活特异性信号通路，揭示多个潜在诊断与预后标志物。低表达的线粒体相关基因（FIS1、FKBP8、GUK1、GLRX5）与预后相关，提示线粒体功能障碍在免疫失衡中关键作用。未来，结合空间转录组和多组学分析，脓毒症研究将更深入，助力新靶向药物开发和精准治疗策略，为提升患者生存率和生活质量奠定基础。

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