一氧化氮（nitric oxide, NO）是一种重要的细胞信号分子，参与哺乳动物的各种正常生理功能。NO由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）家族通过将L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸产生。产生的NO有助于抵御入侵的病原体，对炎症反应和先天免疫系统至关重要。然而，在另一方面，NOS家族中诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的过表达或失调导致的不适当的过高NO浓度会导致毒性作用，这被认为是脓毒血症重要的发病机制之一。脓毒血症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍^[1-5]。血管低反应性是脓毒血症的常见并发症，可导致持续性低血压、组织灌注不良和多器官衰竭^{[1, 6-7]}。NO是脓毒血症中导致低血压和对儿茶酚胺类血管收缩剂反应性降低的主要驱动因素^[8]。在急诊科中，常将呼出NO作为准确评价脓毒血症患者的诊断指标^[9]。由于iNOS与其诱导产生的NO的重要作用，iNOS研究成为了一个非常受欢迎的领域，许多针对NOS与选择性针对iNOS的抑制剂被研发出来，以通过抑制NOS产生NO来治疗脓毒血症。

1 NOS的结构、分型与调节

NOS催化L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸，在这一过程中产生NO。NOS有三种亚型。其中包括两种依赖钙的且组成型表达的亚型，即神经元型NOS（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）和内皮型NOS（endothelial nitric oxide synthase, eNOS），以及不依赖钙的且诱导型表达的亚型，即iNOS（NOS-2）^[10]。iNOS仅在细胞被诱导或刺激时表达。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是iNOS表达的主要诱导剂^[11]。来源于iNOS的NO可延长平滑肌血管舒张并导致低血压，同时导致脓毒血症中的血管低反应性，iNOS及其诱导产生的NO被认为在脓毒血症中起核心作用。

iNOS作为一种细胞内酶，在血液中难被发现。然而近些年的研究表明，在脓毒血症发作期间，iNOS在循环微泡（microvesicle, MV）中以膜微泡相关iNOS（microvesicle-associated inducible nitric oxide synthase, MV-A iNOS）的形式存在于血液和血浆样本中。纳入的所有脓毒血症患者血浆样本中均可发现并分离出MV-A iNOS，但在非脓毒血症患者或正常对照的血浆样本中则不存在^[12]。MV-A iNOS作为外泌体，在与培养的内皮细胞融合后，iNOS被内化进入细胞。内化的iNOS产生毒性剂量的NO和过氧亚硝酸盐（ONOO-），导致培养的内皮细胞死亡^[13]。MV-A iNOS作为一种脓毒血症的早期血浆生物标志物，在脓毒血症的早期诊断与治疗中发挥重要作用。

2 iNOS信号通路

与iNOS相关的信号通路有两条，分别为LPS、IL-1β和TNF激活的toll样受体4（toll‐like receptor, TLR4）-核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）通路与IFN-γ激活的Janus激酶（Janus kinases, JAK）/转录激活因子（nuclear factor 1 transducer and activator of transcription, STAT）1a通路。不同的诱导剂会触发不同的信号通路。LPS、IL-1β和TNF激活TLR4-NF-κB通路。以LPS为例，在巨噬细胞中，LPS首先激活细胞膜上的TLR4。TLR4复合物的激活会释放有活性的NF-κB，其入核并与iNOS启动子相互作用，并触发iNOS基因的转录。高迁移率族（high mobility group, HMG）蛋白是一类染色体蛋白，其家族成员HMGXB4可以通过结合促炎基因iNOS的启动子区域来调节其表达，从而导致iNOS大量诱导、NO过量产生以及组织损伤^[14]。

IFN-γ激活JAK/STAT-1α通路，促进干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1, IRF-1）的合成。IRF-1与iNOS基因启动子结合并诱导iNOS表达。此外，组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase, HDAC）6是Ⅱ类组蛋白脱乙酰酶的成员，可通过调节信号转导及STAT1的激活和IRF-1的表达，上调巨噬细胞中iNOS的表达^[15]。HDAC6特异性抑制剂tubastatin A可抑制巨噬细胞中HDAC6、Hsp90和iNOS的表达^[16]。

3 NO在脓毒血症中的作用与产生的效应

iNOS在TNF、IL-1β、IFN-γ和LPS的诱导下表达并产生NO，这对机体正常的生理功能至关重要。NO维持微血管血流灌注、抵御入侵病原体，同时减少血小板聚集和微血栓形成，从而对机体起“正面”作用^[17]。然而，当iNOS过度表达或失调导致NO过量产生会对机体产生一系列“负面”影响，这被认为在脓毒血症的发病机制中起关键作用。大量产生的NO作为内皮源性舒张因子，自由扩散穿过细胞膜进入平滑肌细胞，导致血管舒张、低血压。eNOS可能在脓毒血症中发挥一定的保护作用。这可能是非选择性NOS抑制剂导致临床失败的原因之一。eNOS活性降低和表达破坏会导致内皮功能障碍，这是脓毒血症的典型特征。蛋白激酶B/Akt/eNOS通路可能与eNOS的激活相关，NLR家族热休克蛋白结构域3/IL-1β轴可能与eNOS的水解相关^[18-19]。

在脓毒血症休克患者的血浆中发现高浓度的亚硝酸盐和硝酸盐，这是NO所产生的两种稳定产物。同时NO可以与超氧阴离子反应生成有毒的活性氧化剂ONOO-，从而成为一种潜在的促炎和细胞毒性因子，并可能导致组织损伤^[20]。NO的这些“负面”影响与NO对机体的“正常”作用相互平衡。

NO会导致多器官功能损伤与衰竭，包括心脏、肺部、肾脏等。NO会导致脓毒性心肌功能障碍，这种影响是复杂的^[21-23]。脓毒血症中，iNOS所导致的NO过量生成被认为可以维持左心室在舒张期的充盈能力，对晚期心肌缺血有一定益处。但是大量的NO会损害心肌收缩能力，显著降低心率与心输出量，且导致强烈的血管舒张而对体循环产生有害影响。这种常表现为心室扩张、射血分数降低和收缩能力减弱的心功能障碍也被称为脓毒血症诱导的心肌病^[24]。NO也会导致脓毒性肺损伤^[25-26]。NO作为一种选择性肺血管扩张剂可能因为改善气体交换对脓毒性肺损伤有一定益处。然而，肺内iNOS产生的过量NO会导致缺氧性肺血管收缩能力丧失进而加重低氧血症^[27]。研究表明抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1可通过抑制氧化应激、减轻炎症同时刺激再生环境对抗脓毒血症诱导的急性肺损伤^[28]。

4 NOS抑制剂在脓毒血症中的应用 4.1 竞争性抑制剂

大多数发现的NOS竞争性抑制剂与L-精氨酸直接竞争。它们可以有两种竞争性抑制的方式：一是可逆地抑制L-精氨酸结合，二是与L-精氨酸竞争，然后以时间、浓度或NADPH依赖性的方式不可逆地灭活NOS^[10]。竞争性抑制剂可分为两种，非选择性NOS抑制剂和选择性iNOS抑制剂。尽管临床前模型效果显著，但遗憾的是，到目前为止，所有抑制NOS的临床尝试均告失败^[29]。

非选择性NOS抑制剂主要是精氨酸衍生物。N-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-nitro L-arginine methyl ester, L-NAME）和Nω-甲基-L-精氨酸盐酸盐（L-Nω-monomethylarginine, L-NMMA）是报道最早的一些竞争性非选择性NOS抑制剂。其中L-NMMA既是iNOS的竞争性抑制剂，也是其慢速失活剂（可能通过一个羟基化中间体和血红素丢失）。使用L-NMMA或L-NAME治疗脓毒血症可恢复全身血管阻力，但会显著降低心输出量和股动脉血流量。N-硝基-L-精氨酸和N-氨基-L-精氨酸也是非选择性竞争性NOS抑制剂。在另一项研究中，N-氨基-L-精氨酸可增加全身和肺血管阻力，但会降低心率、心输出量以及全身氧输送和摄取，且与病死率增加相关。同时补充L-精氨酸并未改变这些结果。尽管早期动物研究表明非选择性NOS抑制剂对控制脓毒血症的低血压效果良好，在临床环境中使用非选择性NOS抑制剂治疗脓毒血症和感染性休克的尝试取得的成功有限。非选择性NOS抑制剂实际上会加重脓毒血症休克患者的心功能障碍并提高病死率。在上述使用L-NMMA的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中，肺动脉高压是非选择性NOS抑制的主要并发症。L-NMMA还会降低心输出量和全身氧输送，增加全身和肺血管阻力以及平均动脉血压。这可能与L-NMMA等非选择性地抑制了具有保护作用的eNOS有关。

选择性iNOS抑制剂有许多种类，主要包括含乙酰胍基的精氨酸类似物和非氨基酸衍生物和亚甲基蓝。含乙酰胍基的精氨酸类似物的代表药物是N6-（1-亚氨基乙基）-L-赖氨酸[N6-(1-Iminoethyl)-L-lysine, L-NIL]。L-NIL是一种竞争性失活的高度选择性iNOS抑制剂，对iNOS的选择性是nNOS的28倍，其在体外比L-NMMA和硝基精氨酸更有效。L-NIL可恢复平均动脉血压，在高动力性猪内毒素血症中不影响心输出量或氧交换。尽管如此，L-NIL具有不良的物理性质，因此设计了一种L-NIL的前药形式，即四唑酰胺L-NIL-TA，其在体外对人iNOS无活性，但具有口服生物利用度，可在体内水解至L-NIL，且活性与L-NIL相当。

非氨基酸衍生物包括胍类化合物、硫脲及异硫脲类化合物和二异硫脲类化合物。胍类化合物的代表药物是氨基胍（aminoguanidine, AG）。AG是一种时间依赖性、竞争性的失活剂，作用于所有NOS同工酶，可能优先与iNOS结合。AG具有广泛的生理特性，包括抑制炎症、神经保护功能以及抑制氧化应激和亚硝化应激^[30]。此外，已发现AG可抑制DNA结合的NF-κB，最终抑制炎症细胞因子TNF-α与IL-6的产生，同时降低了心脏、主动脉和血清中的丙二醛、NO代谢产物水平，具有心脏保护作用^[30]。IL-6已成为一种新型诊断脓毒血症的生物标志物^[31]。硫脲及异硫脲类化合物的代表药物是S-甲基异硫脲（S-methylisothiourea, SMT）。SMT是一种更具选择性的iNOS抑制剂。在一项用于比较非选择性NOS抑制剂L-NAME与选择性iNOS抑制剂SMT的猪内毒素血症模型中，在5 h的观察期内，与SMT或安慰剂相比，L-NAME导致心输出量更早且更持久地下降。然而，SMT并非不影响心输出量，与对照组（即未进行内毒素攻击）相比，L-NAME和SMT均导致左心室扩张和心输出量减少，但只有L-NAME对右心室扩张有害，且L-NAME对心输出量的影响更严重。犬尿那敏尿素和硫脲在近些年被证明是iNOS或双重iNOS和nNOS抑制剂，具有较低的eNOS抑制性。尽管它们的效力不大，但分子模型支持它们与L-精氨酸竞争的假设^[32]。二异硫脲类化合物的代表药物是N-3-氨基甲基-苄基乙酰胺[N-(3-aminomethyl-benzyl)acetamide, 1400W]。1400W是一种非常有效和高选择性的iNOS抑制剂。1400W对eNOS和nNOS弱竞争性抑制，对iNOS的抑制是时间和NADPH依赖性的。1400W并未被酶修饰或作为底物利用，而是通过一种与胆绿素丢失血红素相一致的机制使iNOS失活。1400W具有与L-NIL相似的宏观血流动力学特性，均可恢复平均动脉血压，使治疗组呼出空气中的NO浓度降低，且不影响心输出量或氧交换。同时，1400W可显著逆转脓毒血症中血管紧张素Ⅱ诱导的血管低反应性。

亚甲基蓝（methylene blue, MTB）是选择性iNOS抑制剂和鸟苷酸环化酶的抑制剂。对于脓毒血症所导致的机体低血压，由于NO所导致的对儿茶酚胺类反应性降低，使用肾上腺素能药物效果不佳。而使用MTB使得平均动脉压和全身血管阻力显著增加，并且对肺功能无不良影响，但病死率很高。而当MTB与血管加压药联合给药时可将病死率降低46%^[33]。近期研究表明亚甲基蓝与平均动脉压升高、病死率降低、心肌损伤减少、住院时间缩短相关^[34-35]。除此之外，MTB治疗的患者停用血管加压药的时间更短，这表明使用MTB可持续减少血管加压药需求^[17]。但值得注意的是，除了使用MTB可减少血管加压药需求外，尚未证明有其他显著的临床相关益处，并且使用MTB还伴随着显著的不良反应。已有案例显示，接受MTB治疗后，会使尿液、皮肤、黏膜，甚至大脑和心脏呈蓝绿色。这是由于无色代谢产物白亚甲蓝在接触大气中的氧气时被氧化为亚甲蓝所致^[36]。同时，由于MTB的血管收缩作用导致的后负荷过度增加会加重脓毒血症休克患者的心肌功能障碍，导致心脏指数进一步降低^[37]。目前，大多数关于MTB在脓毒血症休克中应用的研究都是观察性的，由于样本量小、异质性高且方法学质量差，尚未得出指导临床实践的最佳结论。尽管已有案例建议在脓毒血症早期，确认血管床充分充盈并在超声心动图上确认心脏指数和心脏收缩力正常的情况下给予MTB治疗^[37]，但由于样本量过少，尚需更进一步的大样本量的系统研究来验证其结果的准确性。

4.2 二聚体抑制剂

除竞争性抑制剂之外，还有另一种NOS抑制的机制是抑制活性iNOS二聚体的形成。BBS-2是一种新型的、高度选择性的iNOS合成二聚化抑制剂。它可以在不影响全身血压的同时，逆转脓毒血症诱导的心肌收缩抑制，表现为左心室每搏功和每搏输出量得以保留。同时，BBS-2还可以改善肺气体交换、肺顺应性和气道阻塞，并减轻气管血流、肺淋巴流量和毛细血管渗漏的增加。

4.3 内源性NOS抑制剂

由于NO对机体的复杂影响，导致通过抑制NO产生来治疗脓毒血症的研究受到极大挑战。近年来，对NO通路的新认识表明，不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine, ADMA），作为一种内源性产生的NOS抑制剂，可能在脓毒血症的病理生理学以及缺血-再灌注期间的器官损伤中发挥重要作用^[38-39]。几项研究表明血浆ADMA水平与脓毒血症患者危重程度病死率具有相关性^[40-41]。在脓毒血症和其他形式的危重患者中发现高ADMA水平^[42]。高水平的ADMA也与脓毒血症中发生的血流动力学改变有关，包括肺动脉高压、心律失常发生率增加、微循环障碍、心肌功能障碍以及局部组织灌注受损和终末器官损伤。此外，其他研究表明，危重患者出现高水平的ADMA，其与病死率相关。在临床前研究中，ADMA代谢酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）基因缺失导致ADMA增加，这大大降低了多种微生物脓毒血症模型的生存率，而DDAH表达增加导致ADMA减少，这使器官得到保护以及生存率提高^[43-45]。一项针对怀孕小鼠脓毒血症的研究发现，通过使用ADMA选择性抑制剂（L-257）抑制ADMA的代谢，可在不损害免疫细胞功能的情况下减少血管NO的合成，当与广谱抗生素亚胺培南联合使用后，可显著提高生存率，改善孕期脓毒血症的结局^[46]。最近，一种新型治疗性体外装置提供了一种高度安全有效的方法来专门降低ADMA，使用该装置可以在不让患者接触药物的情况下降低ADMA^[47]。

人类NOS抑制剂临床试验失败可能部分说明了脓毒血症啮齿动物模型中NO的机制与效应和人类不同。对脓毒血症啮齿动物模型的研究显示iNOS诱导会产生高水平的NO。然而，与之相反，脓毒血症和休克患者全身产生的NO要么没有改变，要么实际上可能减少。通过外周动脉张力计测量的NO依赖性反应性充血减少也表明了人类脓毒血症中NO生物利用度降低的证据。外源性L-NAME或内源性ADMA都可能导致NO生物利用度降低，这可能会加剧脓毒血症的病理反应^[38]。这可能表明，在降低ADMA水平，使ADMA的病理水平正常化的条件下，直接提供NO供体，提高NO生物利用度可能是治疗脓毒血症的一种全新的治疗策略^[48]。最近，使用释放NO的纳米颗粒持续递送外源性NO已被证明可以改善微血管血流，减少炎症，并显著提高LPS诱导的内毒素血症后小鼠的72 h生存率^[49]。尽管这些研究为提高NO生物利用度治疗脓毒血症提供了令人鼓舞的临床前和早期临床证据，但这些分子作为治疗剂的开发仍然存在重大挑战^[50]。

4.4 抗MV-A iNOS单克隆抗体

MV-A iNOS作为一种新型生物标志物，可能成为在器官功能障碍发生前治疗脓毒血症的新型治疗靶点。MV-A iNOS具有致死性，当含有iNOS的微泡处于循环系统中时，由于缺乏两种必需的辅因子，iNOS是一种无活性的酶。然而，一旦循环中的MV-A iNOS被易感的受体细胞内化，MV - A iNOS就会成为一种活性酶，因为其所有必需的底物和辅因子在受体细胞内均存在。进入易感受体细胞后，iNOS就会产生毒性剂量的NO，导致细胞损伤和死亡，进而引发器官功能障碍^[51]。

已有研究表达出三种人源化抗MV-A iNOS单克隆抗体，其在三种不同的脓毒血症动物模型中可有效拯救小鼠免受脓毒血症^[52]。这种治疗的有效性与时间和剂量有关。如果早期并且高剂量给药，人源化抗MV-A iNOS单克隆抗体可以挽救高达80%的脓毒血症动物。

4.5 中药疗法

越来越多的研究表明，某些中药可以通过抑制NOS治疗脓毒血症。土贝母皂苷在多种不同肿瘤中显示出抗肿瘤活性^[53-55]。在脓毒血症中，土贝母皂苷可能通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路来降低iNOS表达。同时，土贝母皂苷阻止了硝酸盐的增加，增强了血管对儿茶酚胺的反应性，提高了脓毒血症小鼠的存活率^[56]。黄连素是一种天然的五环异喹啉生物碱，具有广泛的药理作用，在临床条件下广泛用于治疗不同的疾病，包括高血压、中风、糖尿病、癌症、动脉粥样硬化和病毒感染^[57-60]。黄连素治疗脓毒血症小鼠可改善心室功能，并降低血浆心肌损伤标志物、炎症因子和氧化应激水平^[61]。此外，它还增加了NOS活性，并上调了p-Akt和磷酸化eNOS的蛋白表达，这表明黄连素激活了Akt/eNOS通路^[58]。

5 结语

iNOS及其诱导产生的NO已被证明既有正面作用，又有负面影响。NO对正常的炎症反应至关重要，而iNOS与NO的失调与各种慢性和急性疾病有关。尽管多种iNOS抑制剂在动物模型中显示出治疗脓毒血症的巨大前景，但迄今为止，它们在临床试验遭遇了极大的失败。该领域的进一步努力应侧重于了解iNOS/NO在生物系统中的复杂作用，包括正面与负面作用。同时，ADMA和MV-A iNOS作为新型生物标志物与脓毒血症的潜在治疗靶点，值得做更进一步的研究探索。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突