2015, Vol. 24
10080 广州，中山大学附属第三医院肾内科(熊海霞);
10080 广州，杭州师范大学附属医院急诊科(夏金明)
心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后血浆致炎因子水平迅速升高，高水平的炎症因子可导致器官损伤，甚至多脏器功能障碍[1, 2, 3]。炎症因子水平如TNF-α 对缺血脑组织具有严重的损害作用，其水平高低与神经功能预后密切相关，拮抗TNF-α对缺血脑组织具有保护作用[3, 4]。
乌司他丁(Ulinastatin，UTI)是从人尿中提取的蛋白酶抑制剂，对脑的缺血-再灌注损伤具有保护作用[5, 6]。既往的研究表明UTI的保护作用和抗炎症反应有关[7, 8],UTI 可减少核转录因子NF-κB 激活，下调致炎因子的表达[9]。本研究欲从UTI对CPR后脑组织炎症反应的影响探讨UTI减轻CPR后脑损伤的可能机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物36只健康成年雄性Wistar大鼠,15~16月龄，体质量(395.5±36.7)g,购自中山大学实验动物中心。本实验经中山大学附属第一医院伦理委员会批准，在中山大学附属第一医院卫生部辅助循环重点实验室进行。动物购进后在SPF级动物房饲养一周，实验前晚禁食不禁水。动物麻醉：戊巴比妥钠(sigma公司，德国)30 mg/kg，由腹腔内注入，酌情给予1/4的首剂量维持。
1.2 手术操作麻醉成功后，固定于操作台上。胸、背部皮肤备皮。用16 G鞘管经口气管插管，接小动物呼吸机(RODENT VENTILATOR 683. Harvard Apparatus,Inc. USA)，通气频率75次/min，潮气量15 mL/kg，根据血气分析结果调整呼吸机参数，PCO2控制在35~45 mmHg之间(1 mmHg=0.133 kPa)。常规Ⅱ导联心电监护，24 G留置针(Becton Dickinson Medical Devices CO,Ltd，中国苏州)穿刺右股动静脉，动脉管接高敏感换能器监测动脉血压。4通道生理信号采集分析系统(BIOPAC SYSTEMS MAP150,Inc. MP100A-CE Santa Barbara,USA)连续记录心率、血压信息。
1.3 实验分组和标本采集36只Wistar大鼠按照笔者前期的心外膜致颤的研究方法[10, 11, 12]诱发室颤(ventricular fibrillation,VF)，VF持续7 min后进行CPR，2 min后进行除颤，每3 min给予肾上腺素20 μg/kg 静脉注射，如此周而复始，直至恢复自主循环(return of spontaneous circulation,ROSC)，如持续15 min未ROSC，宣布复苏失败。ROSC后实验动物分为两组，乌司他丁治疗组和对照组。乌司他丁组ROSC后立即给予乌司他丁(广州天普生物制药公司，广州)10 000 U/kg (UTI组)，对照组ROSC后立即给予等体积的PBS(PBS组)静脉注射。VF(0)前和ROSC后2、4、8 h采血检测血浆炎症因子TNF-α和IL-6水平。ROSC后2、4、8 h 每组各时间点处死3只动物取大脑皮层液氮保存用于检测TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达水平，检测核转录因子NF-κB p65的核/浆转换率。ROSC后72 h 处死动物，取大脑行NISSL和TUNEL凋亡染色，计数存活细胞数和凋亡神经元细胞数。
1.4 荧光定量PCR检测脑组织TNF-α和IL-6的mRNA水平总RNA提取：取脑组织用Trizol提取总RNA，严格按照试剂盒操作说明书进行，并通过凝胶电泳检测其完整性。cDNA 的合成: 取5 μL 总RNA 进行逆转录反应,严格按照M-MLV 逆转录酶(上海生工生物科技有限公司)说明书进行操作。Real-time PCR：根据Genbank大鼠的基因序列设计β-actin、TNF-α和IL-6引物。β-actin-F: GCGCTCGTCGT CGACAAC 和 β-actin-R: ATACCCACCA TCACACCCT; TNF-α-F: CCACCACGCTCTTCTGTC 和 TNF-α-R: GCCCATTT GGG AACTTCT; IL-6-F: TCACAGAGGATACCACCCA 和 IL-6-R: AGAATT GC CATTGCACAAC。在电泳仪(9700 Sequence Detection System，美国)上进行扩增，反应条件: 94 ℃ 15 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，共40个循环。TNF-α和IL-6 mRNA 的表达为目的基因和β-actin的比值。
1.5 血浆、脑组织匀浆中TNF-α和IL-6蛋白质量浓度测定取大脑皮层匀浆，用BCA法测定匀浆蛋白浓度。用ELISA法检测血浆和脑组织中TNF-α和IL-6质量浓度，试剂盒购自Rapidbio公司(美国)，严格按照试剂盒操作说明书进行。
1.6 NF-κB p65蛋白水平检测处理不同时段脑组织冻存标本，按照核/胞浆蛋白提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)说明,提取胞浆蛋白和核蛋白,BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜,5%的脱脂奶粉封闭2 h,滴加一抗(1∶ 500) 4 ℃过夜,TBST 洗膜，5 min×3次,滴加HRB标记的二抗(1∶ 20 000) 室温下孵育1 h,TBST洗膜，5 min×3次,Milipore 发光液浸泡1 min，Koda 胶片曝光，显影、定影，计算蛋白灰度。NF-κB p65(Santa Cruz Biotechnology，美国)，PCNA (Newcastle-upon-Tyne,英国)，GAPDH (Sigma-Aldrich Company,美国)。
1.7 脑组织NISSL和TUNEL染色参照笔者以往的研究方法进行NISSL和TUNEL染色[11, 12]。在光镜(OLYMPUS BX51，日本)下观察分析结果，每张切片随机选取6个标准视野，计算每400倍视野下100像素内顶叶皮层区凋亡神经元细胞数。
1.8 统计学方法数据录入SPSS 13.0统计软件包，计量资料依据正态检验(Kolmogorov-Smirnov)结果分别用均数±标准差(x ±s)或四分位数法表示，依据正态检验结果用成组t检验或秩和检验(Mann-Whitney rank)，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 诱发VF和CPR情况所有动物均成功诱发VF并获得ROSC，实验动物ROSC后成昏迷状态，需要机械辅助通气。PBS组有4只，UTI组有7只动物存活到实验结束，两组之间差异无统计学意义。两组动物VF前的生理学参数和复苏相关指标之间差异无统计学意义，见表 1。
| 指标 | VF+PBS ( n=4) |
VF+UTI ( n=7) |
P值 |
| 体质量(g) | 384±23 | 394±16 | 0.419 |
| 心率(次/min) | 83±11 | 82±12 | 0.215 |
| 平均动脉压(mmHg) | 142±23 | 144±18 | 0.167 |
| 基础生命支持时间(s) | 406±28 | 394±32 | 0.754 |
| 除颤次数 | 1.7±1.0 | 2.2±0.9 | 0.603 |
| 注：1 mmHg=0.133 kPa | |||
VF前两组动物的血浆TNF-α和IL-6水平基本相似，ROSC后PBS组TNF-α和IL-6水平显著升高至VF前的2.2~3.7倍，而UTI治疗可明显抑制TNF-α和IL-6水平的升高，ROSC后各观察点UTI组血浆TNF-α和IL-6水平均显著低于PBS组，见表 2。
| 指标 | Basal | ROSC 2 h | ROSC 4 h | ROSC 8 h |
| TNF-α(ng/mL) | ||||
| PBS组( n=4) | 8.7±2.1 | 24.5±1.6 | 29.5±2.1 | 21.3±1.5 |
| UTI组( n=7) | 8.8±1.1 | 17.7±1.4 a | 21.9±2.1 a | 17.1±0.6 a |
| IL-6(ng/mL) | ||||
| PBS组( n=4) | 142.0±20.3 | 259.5±18.6 | 353.1±26.4 | 293.6±26.9 |
| UTI组( n=7) | 144.5±17.8 | 208.9±14.1 a | 281.5±25.9 a | 251.8±15.3 a |
| 注：与PBS组比较，a P<0.05 | ||||
ROSC后UTI组TNF-α和IL-6的mRNA 和蛋白水平显著均低于PBS组，见表 3。
| 指标 | mRNA表达 | 蛋白表达(ng/μg) | ||||||
| Basal | 2 h | 4 h | 8 h | Basal | 2 h | 4 h | 8 h | |
| TNF-α | ||||||||
| PBS组(n=4) | 0.39±0.25 | 1.4±0.1 | 3.9±0.4 | 3.6±0.4 | 0.76±0.21 | 1.56±0.11 | 1.88±0.04 | 1.82±0.09 |
| UTI组(n=7) | 0.41±0.19 | 1.1±0.0a | 2.4±0.5a | 2.2±0.1a | 0.65±0.14 | 1.25±0.06a | 1.49±0.09a | 1.36±0.04a |
| IL-6 | ||||||||
| PBS组(n=4) | 3.7±0.46 | 13.9±1.2 | 30.3±6.3 | 22.7±3.9 | 0.82±0.27 | 2.03±0.12 | 3.51±0.21 | 3.01±0.21 |
| UTI组(n=7) | 4.1±0.52 | 8.6±1.4a | 17.6±2.8a | 15.9±2.4a | 0.93±0.24 | 1.59±0.14a | 3.04±0.08a | 2.65±0.10a |
| 注： 与PBS组比较，aP<0.05 | ||||||||
ROSC后2、4、8 h PBS组NF-κB p65的转位情况分别为(1.08±0.08),(1.02±0.05)和(0.9±0.02)高于UTI组的(0.86±0.02),(0.82±0.03)和(0.83±0.01)，P值分别为0.021,0.020 和 0.019，见图 1。
 |
| ROSC后UTI治疗后2 h、4 h、8 h，细胞核内NF-κB p65表达量逐渐下降，而细胞胞浆内NF-κB p65表达量逐渐增加；PBS治疗组中细胞核及细胞浆内NF-κB p65表达则与UTI组呈相反趋势，表明UTI能够对大鼠ROSC后NF-κB p65核转位产生影响 图 1 UTI对ROSC后大鼠大脑皮层NF-κBp65核转位的影响 Fig 1 Effect of UTI on the translocation of NF-kB p65 from the cytoplasm to the nucleus |
ROSC后PBS组大脑皮层存活神经元细胞数为(19±2)个/标准视野，低于UTI组的(22±3)个/标准视野，P=0.02；而凋亡细胞数PBS组为(13±3)个/标准视野，高于UTI组的(10±2)个/标准视野，P=0.01，见图 2。
 |
| 图 2 UTI对ROSC后大鼠大脑皮层神经元细胞损伤的影响(×40) Fig 2 Effect of UTI on Nissl-stained neurons and TUNEL-positive cells in the cortex (×40) |
本研究结果表明，ROSC后UTI治疗可以减轻大鼠全身炎症反应和大脑皮层炎症反应，使大脑皮层NF-κB p65的核转换率降低，从而减少TNF-α 和 IL-6的mRNA和蛋白水平。同时，本研究还发现UTI组存活神经元细胞数多于PBS组，而凋亡细胞数少于PBS组，这些结果表明，UTI减轻ROSC后大脑皮层炎症反应可以减轻神经元细胞损伤。
本研究结果表明ROSC后大鼠血浆TNF-α和IL-6迅速升高，体内和体外的确切证据表明缺血-再灌注损伤和致炎因子TNF-α和IL-6有很大关系[13]。TNF-α不仅是由聚集在缺血区的炎症细胞所产生，而且缺血组织本身也可以成为产生TNF-α的重要来源，正如本研究所证实的一样，ROSC后大鼠大脑皮层TNF-α表达显著增加[14]，表明缺血-再灌注后脑组本身也可以产生大量的TNF-α。IL-6是脑缺血后产生的另一个重要的致炎因子，和脑梗死面积有关，是脑功能恶化的重要预测因子[15, 16]。本研究中UTI组血浆和脑组织中TNF-α和IL-6水平显著低于PBS组，表明减轻炎症反应有助于减轻脑组织的缺血-再灌注损伤。
NF-κB是调控炎症反应的枢纽因子[17],在缺血-再灌注的急性期被激活[18, 19]，调控致炎因子的产生，因此抑制NF-κB激活可以抑制炎症反应，从而减少组织损伤。本研究中PBS组TNF-α和IL-6 水平显著升高,高于UTI 组，表明UTI可能通过抑制ROSC后NF-κB 激活，从而减少致炎因子的转录，其直接证据有待进一步研究证实。
研究表明，UTI减轻缺血-再灌注损伤的机制除减轻炎症反应外，还与减轻氧化应激损伤[5, 6]及保护线粒体功能有关[4]，但减轻炎症反应是目前公认的UTI减轻缺血-再灌注损伤的重要机制。本研究证实炎症反应在ROSC后脑损伤中的具有重要作用，而UTI是重要的抗炎症反应药物，ROSC后UTI治疗可以减轻脑组织炎症反应和脑损伤，这将为UIT用于ROSC后患者提供实验依据。
UTI降低ROSC后Wistar大鼠全身炎症反应，减少大脑皮层NF-κB通路的激活，减少致炎因子TNF-α和IL-6的表达，从而减少神经元细胞凋亡，促进细胞存活。
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