2015, Vol. 24
褪黑素(melatonin，MT)是目前已知作用最强的亲脂性抗氧化剂。研究表明，褪黑素及其代谢产物具有高效的抗氧化性，既能清除氧自由基及中间产物，又能调节包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、触酶、谷胱甘肽还原酶、一氧化氮合酶等抗氧化酶的表达和活性，间接发挥抗氧化作用；同时褪黑素可以减少线粒体电子传递链产生的电子漏，从而减少线粒体内氧自由基的产生[1, 2]。Lin和Lee[3]研究表明，褪黑素可明显减轻脑缺血大鼠梗死体积及减轻脑水肿和脑组织氧化损伤。本实验通过建立脑出血大鼠模型，观察脑出血后OX42阳性小胶质细胞表达和SOD活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化，探讨褪黑素在脑出血中可能的神经保护机制。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂STOELTING TL-2型鼠脑立体定位仪(美国)；FEI Tecnai G212型电子透射显微镜(荷兰FEI公司)；Eppendorf centrifuge 5415D型高速离心机(德国Eppendorf公司)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；Ⅶ型胶原酶(美国Sigma公司)，褪黑素(德国Calbiochem公司)；OX-42小鼠抗大鼠抗体(美国Biolegend公司)；鼠抗体免疫组化(DAB)试剂盒(北京欣博盛生物科技公司)；SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物研究所)；其他试剂均来自国产。
1.2 方法 1.2.1 实验动物与分组130只健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，8～10周龄，体质量(240±20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。随机(随机数字法)分为：正常组(Normal组，n=10)、假手术组(sham组，n=40)、脑出血模型组(Model组，n=40)，褪黑素治疗组(MT组，n=40)；后三组组内再随机分成12 h、24 h、2 d、4 d、7 d共5个时间点，每个时间点8只。
1.2.2 脑出血大鼠模型制备及处理按照Rosenberg法制作大鼠脑出血模型[4]，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上，使用《大鼠脑立体定位图谱》[5]进行苍白球定位：以微量进样器，缓慢注射含0.2 U/μL的Ⅶ型胶原酶的生理盐水2 μL，留针5 min后，缓慢拔出针头，缝合皮肤，常规消毒。假手术组以同样的方法在此位点注入2 μL生理盐水。手术大鼠清醒后按文献[6]的5级神经功能缺陷评分方法对大鼠进行神经功能评分。选择神经功能评分在Ⅱ级以上的大鼠视为脑出血模型成功，剔除神经功能评分0级或Ⅳ级的大鼠。正常组不作任何处理；假手术组每天1次腹腔注射2 mL注射用水；模型组每天1次腹腔注射2 mL注射用水；褪黑素组每天1次腹腔注射1 mg/mL的褪黑素10 mL/kg，直到处死。
1.2.3 透射电镜观察小胶质细胞形态10%的水合氯醛深度麻醉大鼠，快速断头处死后，切取出血侧大脑顶叶皮层组织，经固定、脱水、包埋后，超薄切片、双重染色(醋酸双氧铀、枸橼酸铅)，透射电子显微镜下观察，拍摄细胞形态照片。
1.2.4 免疫组织化学法检测OX42阳性细胞表达各时间点随机选取4只大鼠，取脑切片，按常规步骤行免疫组织化学染色，检测OX42阳性细胞表达情况，每张切片以血肿周围为观察区，随机选取5个不重复200高倍镜视野，计数OX42平均阳性细胞数。
1.2.5 脑组织MDA含量、SOD活性测定各时间点大鼠均取脑组织0.2 g，在预冷的生理盐水中漂洗，快速剪碎脑组织，匀浆、离心，取上清，按照考马斯亮蓝蛋白法测出样品中蛋白含量，硫代巴比妥酸比色法(TAB)测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法(XTO)测定SOD活性。
1.3 统计学方法计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间两两比较采用方差分析和SNK-q检验，SPSS 13.0软件进行数据分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 脑出血后出血侧皮层小胶质细胞形态脑出血后2 d时，模型组大鼠出血侧皮层小胶质细胞明显活化，呈类球型或长杆型，主要分布在损伤神经元附近，褪黑素组小胶质细胞呈轻度活化，数量较少。见图 1。
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| A：MT组(×2000) ；B：Model组(×5000) 图 1 大鼠脑出血后2 d时皮层小胶质细胞形态(醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色，电镜) Fig 1 The morphology of cortical microglia cell in rats at 2 d after ICH (double staining，electron microscope) |
OX42阳性细胞的表达主要位于血肿周围区域及出血侧皮质，OX42阳性反应小胶质细胞染色呈棕黄或褐棕色，形态以球形、分枝形为主，呈颗粒状、点状分布。正常组仅见到极少量OX42阳性细胞表达；假手术组针孔附近脑组织可见少量OX42阳性细胞表达，脑出血后12 h时模型组血肿周围区域出现OX42阳性细胞表达，1 d时OX42阳性细胞数量达到高峰，4 d时血肿中心小胶质细胞呈阿米巴样形态，7 d时仍有OX42阳性细胞表达；褪黑素组出血后各时间点OX42阳性细胞表达明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图 2。
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| A：正常组；B：假手术组；C：模型组12 h；D：褪黑素组12 h；E：模型组1 d；F：褪黑素组1 d；G：模型组4 d；H：褪黑素组4 d；I：模型组7 d；J：褪黑素组7 d 图 2 大鼠脑出血后不同时间点OX42阳性细胞表达(免疫组织化学染色，光镜，×200) Fig 2 Expression of OX42-positive cell at different time in rats after ICH(immunohistochemical，microscope，×200) |
脑出血后血肿周围组织MDA含量明显升高，1 d时达到高峰之后逐渐下降；与假手术组比较，模型组脑出血后12 h至4 d，MDA含量明显增高(P﹤0.05)； 脑出血后12 h至4 d，褪黑素组MDA含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P﹤0.05)；脑出血后12 h，大鼠脑内SOD活性显著降低，1 d时达到低峰，之后缓慢升高；与假手术组比较，模型组12 h、1 d、2 d、4 d时SOD活性明显降低；褪黑素组SOD活性明显高于模型组，差异有统计学意义(P﹤0.05)。见表 1和表 2。
| 组别 | SOD活性 | ||||
| 12 h | 1 d | 2 d | 4 d | 7 d | |
| Model组 | 45.34±2.36 a | 28.64±2.24 a | 41.98±3.22 a | 50.46±2.78 a | 70.46±3.12 |
| MT组 | 60.85±4.11 b | 51.35±4.08 b | 58.98±5.04 b | 68.72±5.30 b | 75.82±3.60 |
| Sham组 | 83.19±3.66 | 81.82±4.58 | 83.34±5.11 | 80.01±4.40 | 80.26±3.58 |
| Normal组 | 85.86±4.95 | － | － | － | － |
| 注：与Sham组和Normal组对应时点比较，aP＜0.05；与Model组对应时点比较，bP＜0.05 | |||||
| 组 别 | MDA含量 | ||||
| 12 h | 1 d | 2 d | 4 d | 7 d | |
| Model组 | 1.284±0.188 a | 1.612±0.236 a | 1.212±0.152 a | 0.928±0.114 a | 0.875±0.098 |
| MT组 | 0.745±0.088 b | 0.894±0.110 b | 0.804±0.115 b | 0.752±0.095 b | 0.634±0.076 |
| Sham组 | 0.764±0.088 | 0.771±0.075 | 0.744±0.069 | 0.780±0.079 | 0.758±0.059 |
| Normal组 | 0.725±0.061 | － | － | － | － |
| 注：与Sham组和Normal组对应时点比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05 | |||||
生理条件下的小胶质细胞处于静息或休眠状态，数量较少。中枢神经系统小胶质细胞分为脑实质内小胶质细胞和血管周围小胶质细胞。小胶质细胞起源目前还存在争议，袁琼兰等[7]研究发现脑缺血-再灌注大鼠模型再灌注0.5 h时，可见大量形态各异的GSI-B4阳性的小胶质细胞和巨噬细胞，12~48 h数量持续升高，并呈不同形态。研究证实缺血-再灌注时不同损伤区域小胶质细胞形态呈明显的异形性，有来自脑膜、室管膜及室管膜下层的巨噬细胞增殖、迁移。本实验发现，脑出血后第2天时，电镜下观察到出血侧皮层微血管周围活化的小胶质细胞，形态呈卵圆形；损伤的神经元附近同样存在活化的小胶质细胞，形态呈卵圆形、棒形，表明脑出血激活的小胶质细胞可能来源于内源性分枝型小胶质细胞活化和外源性单核细胞浸润。
3.2 脑出血后小胶质细胞活化的时相和诱因缺血缺氧是诱导小胶质细胞活化、增殖的重要因素之一。Soltys等[8]对短暂性全脑缺血后海马和皮质的小胶质细胞进行形态学分析发现，海马区小胶质细胞出现增生和巨噬细胞反应，皮质小胶质细胞数量明显增加。Kato等[9]研究中发现，脑缺血后1 d，海马CA1区增殖核抗原强阳性小胶质细胞达83%，第7天小胶质细胞大量活化增殖，推测脑缺血后巨噬细胞募集主要是脑内静息态的小胶质细胞活化和增殖引起。脑出血同样可诱导小胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变，其形态改变呈一定时间依赖性，脑出血较脑缺血诱导小胶质细胞活化程度更强烈、时间更长。Kowiański等[10]研究发现，采用自体血注射制作的脑出血大鼠模型，用OX42、OX6、ED1分别标记表达CR3补体受体、MHCⅡ类抗原和单核吞噬细胞抗原的小胶质细胞。观察脑出血后1~21 d血肿周围小胶质细胞反应，结果发现，术后第1天，血肿周围出现体积大小不等、轴突细长的OX42阳性细胞；术后3 d血肿周围出现大量濒死状态和可逆性损伤神经元。这些神经元附近可见OX42、OX6、ED1染色阳性小胶质细胞，ED1染色阳性小胶质细胞呈圆形、卵圆形和阿米巴样，具有吞噬能力，第7天血肿内活化的小胶质细胞呈阿米巴样，血肿周围的小胶质细胞呈圆形、卵圆形。3周后血肿周围活化的小胶质细胞逐渐减少，脑内注射生理盐水的对照组中坏死或受损神经元数量较少，小胶质细胞活化范围相应较小。脑出血诱导小胶质细胞活化的内在机制尚不明确，研究表明，神经元细胞损伤后产生的神经递质、一氧化氮、氧自由基等能活化小胶质细胞，损伤的神经元末梢释放的谷氨酸激活神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体介导小胶质细胞活化，活化的小胶质细胞也能够通过释放活性氧、炎症因子等介导自身活化[11, 12, 13]。本实验发现，OX42染色阳性小胶质细胞表达主要位于血肿周围区域及出血侧皮质，脑出血后12 h时血肿周围出现明显OX42阳性细胞，4 d时血肿周围聚集大量阿米巴样形态完全活化的小胶质细胞，7 d时仍有OX42阳性细胞表达。与Kowiański等[10]研究的不同之处，脑出血后血肿周围小胶质细胞活化数量峰值出现于出血后1 d，这可能与脑出血急性期血肿周围存在大面积类似于缺血半暗带的低灌注区，缺血诱导的小胶质细胞激活先于神经元损害和炎症反应的发生，小胶质细胞对神经元去极化十分敏感，可以在无明显病理变化的情况下发生激活反应。
3.3 褪黑素对脑出血后小胶质活化与氧化应激的影响氧化应激(oxidative stress)在脑出血后脑水肿的发生和神经元继发性损伤过程中起着重要作用，而且这种反应贯穿整个脑出血病理过程，与脑出血患者急性期存活率以及后期康复效果密切相关[14]。Wang 和Doré[15]研究表明，脑出血后血肿周围活化的小胶质细胞/巨噬细胞高度表达血红素加氧酶-1，增加氧自由基水平，加重脑出血早期的脑损害；Gao等[16]发现小鼠脑出血后诱导强烈的小胶质细胞活化和巨噬细胞募集，而当小胶质细胞活化被抑制时，脑水肿明显减轻，神经缺损症状相应改善，证明小胶质细胞具有改变脑出血结局的能力。氧自由基和细胞膜上磷酸基结合形成脂键，导致脂质过氧化，生成MDA，破坏血脑屏障，造成脑水肿与神经细胞损。MDA含量间接反映体内氧自由基对机体的损伤程度，SOD活力高低可反映机体清除氧自由基的能力。研究表明，MT可以通过促进神经再生、减轻海马区细胞死亡和炎症反应，对缺氧诱导的新生小鼠神经功能缺损具有短期和长期保护作用[17]。本实验发现，在脑出血后1 d时脑组织MDA含量升高达到峰值，同时激活的小胶质细胞数量也在脑出血后1 d时达到高峰，提示小胶质细胞活化程度与氧化应激水平之间存在一定关联。MT在脑出血急性期显著降低脑组织MDA含量，增加SOD活性，同时MT明显抑制脑出血后OX42阳性细胞表达数量，延缓小胶质细胞活化程度。
综上所述，MT通过其强大的清除自由基能力，可以减轻脑出血氧化应激造成的神经元损伤，抑制小胶质细胞活化与增殖，从而发挥其对脑出血继发性神经损伤的保护作用。
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