中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (5): 488-492
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路建, 肖旺频, 周清河, 耿智隆, 刘东, 王英峰. 芦荟多糖预处理对初进高原重度失血性休克大鼠海马NF-κB和ICAM-1表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(5): 488-492.
Lu Jian, Xiao Wangpin, Zhou Qinghe, Geng Zhilong, Liu Dong, Wang Yingfeng. Effects of aloe polysaccharides pre-emptive treatment on the expressions of NF-κB and ICAM-1 in hippocampal brain tissue in rats with severely hemorrhagic shock for the first time of entering high altitude [J]. Chin J Emerg Med, 2015, 24(5): 488-492.
芦荟多糖预处理对初进高原重度失血性休克大鼠海马NF-κB和ICAM-1表达的影响
路建, 肖旺频, 周清河, 耿智隆, 刘东, 王英峰    
314000 浙江省嘉兴， 嘉兴学院附属第二医院麻醉科(路建、肖旺频、周清河)；
兰州军区兰州总医院麻醉科(耿智隆、刘东、王英峰)
收稿日期：2014-10-16
基金项目：全军“十一五”计划课题项目(06MA083)
通信作者：耿智隆, Email: zlgch@hotmail.com
摘要：目的 探讨芦荟多糖(AP)预处理对初进高原重度失血性休克大鼠海马组织核因子-κB(NF-κB)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达及海马组织细胞凋亡程度的影响。 方法 雄性SD大鼠40只，体质量250～300 g。随机(随机数字法)分为5组(n= 8)：假手术(Sham)组、休克(Shock)组和芦荟多糖预处理(AP)组，AP组按剂量分为0.75 mg / kg(AP1)、1.50 mg/kg(AP2)和3.00 mg/kg(AP3)3个亚组。Sham组仅行动静脉穿刺，不放血；Shock组仅放血，无液体复苏；AP1、AP2、AP3组分别于放血前30 min股静脉注射不同剂量AP。采用股动脉放血法制备重度失血性休克模型，15 min内使平均动脉压降至(35±5)mmHg(1 mmHg = 0.133 kPa)，通过放血或自体血回输维持此水平60 min。于复苏后3 h，放血处死大鼠，冰上取脑分离海马。采用免疫组织化学法检测海马组织NF-κB和ICAM-1的表达，并用TUNEL法检测海马组织细胞凋亡。各组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果 与Sham组比较，Shock组海马组织NF-κB表达水平(5.03±0.42)和ICAM-1表达水平(4.14±0.29)增高，海马组织细胞凋亡数(44.3±7.2)增加(P＜0.05)；Shock组和AP1组间上述各指标差异均无统计学意义。与Shock组比较，AP2组海马组织NF-κB表达水平(3.12±0.34)和ICAM-1表达水平(2.93±0.21)降低，海马组织细胞凋亡数(24.8±3.6)减少(P＜0.05)；AP2和AP3组间上述各指标差异均无统计学意义。结论 芦荟多糖预处理可抑制初进高原重度失血性休克大鼠海马组织NF-κB与ICAM-1表达和减轻海马组织细胞凋亡程度。
关键词： 芦荟多糖     海马     高原     失血     休克     核因子-κB    
Effects of aloe polysaccharides pre-emptive treatment on the expressions of NF-κB and ICAM-1 in hippocampal brain tissue in rats with severely hemorrhagic shock for the first time of entering high altitude
Lu Jian, Xiao Wangpin, Zhou Qinghe, Geng Zhilong, Liu Dong, Wang Yingfeng    
Department of Anesthesiology, The Second Affiliated Hospital of Jiaxing College, Jiaxing 314000, China
Corresponding author: Geng Zhilong, Email: zlgch@hotmail.com
Abstract: Objective To investigate the effect of aloe polysaccharides (AP) pre-emptive treatment on the expression of nuclear factor kappa B(NF-κB), ntercellulor adhesion molecule-1(ICAM-1)and cell apoptosis in hippocampal brain tissue in rats with severely hemorrhagic shock for the first time of entering high altitude. Methods Forty healthy male SD rats weighing 250-300gwere randomly (random number) divided into 5 groups (n=8 each): sham group, shock group and AP group which was further divided into 3 subgroups as per different dosages of AP administered (AP1: 0.75 mg/kg; AP2: 1.50 mg/kg; AP3: 3.00 mg/kg). Rats in sham group were treated with surgical procedure without exsanguination. Rats in shock group were exsanguinated until hemorrhagic shock emerged without resuscitation. Rats in AP subgroups were intravenously infused with given doses of AP in different AP subgroups at 30 min before hemorrhagic shock. MAP was dropped to(35±5)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)in 15 min by bleeding from femoral artery, the mean arterial pressure (MAP) was maintained at (35±5) mmHg for 60 min with bleeding or re-transfusing. At 3hafter resuscitation, rats were sacrificed immediately by bleeding, and the hippocampus of brain was harvested on the ice. The expressions of NF-κB and ICAM-1 in the hippocampus of rats were determined by immuno-histochemical method, and number of cell apoptosis in the hippocampus of rats was determined by TUNEL. The means were compared with analysis of variance and Student-Newman-Keuls test, and statistical significance was established ataP value of less than 0.05. Results Compared with sham group, the expressions of NF-κB (5.03±0.42), ICAM-1(4.14±0.29)and number of cell apoptosis (44.3±7.2) in hippocampal tissue were significantly increased in shock group(P< 0.05). There were no significant differences in these three variables between shock group and AP1 group. Compared with shock group, the expressions of NF-κB (3.12±0.34), ICAM-1(2.93±0.21)and number of cell apoptosis (24.8±3.6)in hippocampal tissue were significantly decreased in AP2 group (P< 0.05). There were no significant differences in these three variables between AP2 and AP3 groups. Conclusions AP pre-emptive treatment can significantly attenuate the expressions of NF-κB, ICAM-1 and number of cell apoptosis in hippocampal tissue in hemorrhagic shock rats.
Key words: Aloe polysaccharide     Hippocampus     High altitude     Hemorrhage     Shock     Nuclear factor kappa B    

失血性休克为临床常见的危重症，再加高原低氧环境，休克患者的微循环障碍更加复杂。随着各种成功的血流动力学的复苏，又造成缺血-再灌注损害。在此过程中，可诱导大量活性氧、炎症因子等生成，这些产物又激活了NF-κB，引起进一步的炎症反应和组织损伤[1]。NF-κB的激活可能是一些炎症介质释放的关键因素，而ICAM-1与NF-κB之间以及诸多细胞因子间复杂的相互作用则可使炎症信号进一步扩大和增强[2, 3]。芦荟多糖(aloe polysaccharides，AP)是一种天然高分子聚合物的减阻剂，经初步研究显示，具有疏通微循环、抗氧化和增加休克早期复苏对象的成活率等作用[4, 5]。目前，关于芦荟多糖对失血性休克后脑损伤的影响研究甚少。本实验拟探讨芦荟多糖预处理对初进高原重度失血性休克大鼠海马组织NF-κB、ICAM-1的表达和海马区神经元凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康雄性SD大鼠40只，体质量250~300 g，购自第四军医大学实验动物科。将大鼠随机(随机数字法)分为5组(每组8只)：(1)假手术组(Sham)，即无休克、无复苏组；(2)休克(Shock)组；(3)AP预处理组，按给药剂量分为0.75 mg/kg(AP1)、1.50 mg/kg(AP2)和3.00 mg/kg(AP3)3个亚组，于放血前30 min分别静脉注射不同剂量AP，随后制备初进高原重度失血性休克模型。

1.2 动物模型和标本的制备

实验动物用汽车由西安2 d内运至兰州榆中马衔山(海拔3 780 m)。全部动物实验在10 d内完成。实验前动物禁食12 h，不禁水。2.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射，麻醉后仰卧固定，分离并暴露右侧股动脉和左侧股静脉，置套管针，栓线固定。右股动脉供测血压和放血，左股静脉供输液输血，200 U/kg肝素静脉注射使全身肝素化以保持套管针通畅。右股动脉套管接压力传感器，经S/5型多功能监护仪(Datex-Ohmeda公司，美国)连接监测血压变化。手术操作完成后稳定10 min，然后采用改良Wigger法[6]复制重度失血性休克模型：经右侧股动脉导管放血，15 min内使平均血压(MAP)降低至(35±5)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，并通过放血或自体血回输维持此水平60 min，同时各组大鼠达到预定MAP的失血量差异无统计学意义，表示模型复制成功。然后在30 min内经左股静脉回输一半失血量和等量乳酸钠林格液。于复苏后3 h，放血处死大鼠，冰上取脑组织，分离海马，标本保存于-80 ℃待测。

1.3 免疫组织化学染色

兔抗大鼠NF-κBp65和ICAM-1多克隆抗体IgG和S-P试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。兔抗大鼠NF-κBp65多克隆抗体IgG(1∶ 100稀释)、兔抗大鼠ICAM-1抗体IgG(1∶ 100稀释)，分别按S-P试剂盒实验步骤操作。经DAB / H2O2显色，棕黄色着染为阳性细胞。用PBS液代替一抗作为阴性对照。每张免疫组化切片在光镜下任选6个高倍视野，用高清晰度彩色医学图文分析系统获得各组NF-κB与ICAM-1阳性细胞的平均吸光度值。

1.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况

采用TUNEL检测试剂盒(Roche，美国)测定细胞凋亡情况。组织石蜡包埋切片脱蜡脱水。蛋白酶K(20 mg/L溶于Tris/HCl中，pH=7.4)室温孵育15 min PBS洗5 min×2；滴加50 μL的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37 ℃孵育60 min；PBS洗5 min×3；滴加50 μL DAB底物溶液，室温孵育10 min；PBS洗5 min×3；中性树胶封片。光镜下观察，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞，在同一光强度、同一放大倍数(×400)下分析，取6个阳性视野，计数器计数，计算平均凋亡细胞数。

1.5 统计学方法

应用SPSS 10.0统计分析软件处理，各组计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠造模结果比较

各组大鼠的体质量差异无统计学意义。除Sham组外，其余各组达到预定MAP的失血量(mL)分别为(6.67±0.78)、(6.56±1.03)、(6.72±0.68)和(6.69±0.98)，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各组大鼠海马组织NF-κB与ICAM-l表达的变化

与Sham组相比，Shock组NF-κB与ICAM-1表达增高(P＜0.05)；Shock组和AP1组之间NF-κB与ICAM-1表达差异无统计学意义(P＞0.05)。与Shock组比较，AP2组NF-κB与ICAM-1表达降低(P＜0.05)；AP2和AP3组之间NF-κB与ICAM-1表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1

表 1各组大鼠海马组织NF-κB和ICAM-1 吸光度值的比较(n=8，x±s) Table 1The comparison of NF-κB and ICAM-1 absorbance value in the rat hippocampus in every group(n=8，x±s)
组别 NF-κB ICAM-1
Sham组 1.52±0.60 1.39±0.34
Shock组 5.03±0.42a 4.14±0.29a
AP1组 4.70±0.31a 3.86±0.23a
AP2组 3.12±0.34ab 2.93±0.21ab
AP3组 3.23±0.28ab 2.94±0.25ab
F值 83.805 94.577
P值 0.000 0.000
注: 与Sham组比较, a P＜0.05; 与Shock组比较, b P＜0.05
表选项
2.3 TUNEL法检测结果

与Sham组(3.5±0.8)相比，Shock组(44.3±7.2)凋亡细胞数增高(P＜0.05)；Shock组和AP1组(37.1±6.5)之间凋亡细胞数的差异无统计学意义(P＞0.05)。与Shock组比较，AP2组(24.8±3.6)凋亡细胞数降低(P＜0.05)；AP2组和AP3组(26.7±3.4)之间凋亡细胞数的差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 1。

A:sham组；B：Shock组；C：AP1组；D：AP2组；E：AP3组 图 1各组大鼠海马组织细胞凋亡(TUNEL×400) Fig 1The apoptosis of hippocampus in the rat in every group(TUNEL×400)
图选项
3 讨论

失血性休克后脑损伤与很多因素有关，包括氧自由基增加、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸蓄积等，而缺血灶炎症反应增强成为近年研究的重点。再灌注时的炎症反应促进了继发性损害，是脑缺血-再灌注损伤的主要原因之一。

NF-κB是炎症反应中的重要信号转导分子，能诱导炎症因子的表达与凋亡。在失血性休克后，随着大量活性氧、炎症因子等的生成，继而激活了NF-κB，进一步加重炎症反应和组织损伤[7]。NF-κB活化被认为是介导或加剧脑缺血-再灌注后炎性损伤的中心环节，活化的NF-κB可促使黏附分子和细胞因子等表达[8]，可直接调控参与脑缺血-再灌注后炎性损伤。脑缺血-再灌注时，白细胞与微血管内皮细胞间的黏附性增强，白细胞贴壁、嵌塞并游出微血管外，进而释放大量炎症因子，造成局部组织损伤，在这一过程中ICAM-1起到了关键性作用。ICAM-1为NF-κB下游的靶基因表达产物，可介导白细胞与微血管内皮细胞间的黏附过程，促进白细胞在局部组织的浸润[9]。研究显示，脑损伤后，脑组织中NF-κB被活化、ICAM-1及炎症因子(TNF-α、 IL-1β和IL-6)的表达增强可以加重脑损伤[10]。在给予抗氧化剂(N-Acetylcysteine)后，可以抑制大脑皮层NF-κB的活化、减少ICAM-1及炎症因子的表达，从而减轻脑损伤[11]。芦荟多糖是一种天然减阻剂(drag reducing polymers，DRP)，平均相对分子质量为4×106。DRP对改善局部或全身性缺血的危重患者具有潜在的治疗价值，有望成为治疗组织或器官灌注不足的新型药物[12]。笔者前期研究显示，芦荟多糖具有抑制炎症反应和抗氧化作用[13]。因此，本实验参照文献[5]设定不同剂量的芦荟多糖，研究其对休克后脑损伤的影响。本研究结果显示，Shock组海马NF-κB、ICAM-1的表达和海马组织细胞凋亡数较Sham组明显增加，提示NF-κB与ICAM-1在休克后脑缺血-再灌注损伤病理过程中起着重要作用。

氧化应激反应是导致缺血-再灌注损伤的重要原因之一，氧化应激可活化NF-κB介导的炎症反应和凋亡。吴晓燕和任江华[14]研究显示，通过抑制氧化应激反应，可以抑制NF-κB的激活，从而减少心肌凋亡及炎症反应，有效地改善心衰患者的心功能。脑缺血-再灌注时机体内促氧化和抗氧化功能失调，导致体内氧化应激反应增强，从而引起脑损伤[15]。NF-κB在脑缺血-再灌注损伤中扮演重要角色[16]。Carroll等[17]研究显示，给予抗氧化剂N-乙酰半胱胺酸可以抑制NF-κB活化，抑制ICAM-1表达和缩小脑梗死体积，提示NF-κB活化在脑缺血-再灌注损伤中起到重要作用。因此，抑制氧化应激反应和NF-κB的活化有可能减轻休克后脑损伤。笔者前期研究显示，芦荟多糖也具有抗氧化作用[13]。本研究结果显示，AP2和AP3组大鼠海马组织NF-κB与ICAM-1的表达水平较Shock组明显降低，海马组织细胞凋亡数明显减少，提示芦荟多糖对休克后脑缺血-再灌注损伤的保护作用可能与其减少NF-κB与ICAM-1的表达有关。本研究发现，Shock和AP1组之间的差异无统计学意义，这可能由于0.75 mg/kg芦荟多糖预处理没有明显救治休克的效应，需要加大剂量才能发挥效应；1.50 mg/kg和3.00 mg/kg芦荟多糖预处理之间救治休克的效应无差别，可能是由于芦荟多糖有封顶效应或者在更大剂量下才有更好的救治休克和脏器保护效应。其更具体的量效关系和作用机制有待于进一步研究。

综上所述，芦荟多糖预处理可能通过疏通微循环和抗氧化等特性，抑制失血性休克再灌注后NF-κB的活化与表达，下调ICAM-1的表达，抑制炎症反应，减轻海马组织细胞凋亡的程度，从而减轻初进高原重度失血性休克后大鼠脑损伤。

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