脓毒症时机体分泌多种炎症因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、缓激肽等,可引起血管内皮细胞通透性增加^{[1, 2]}。血管内皮细胞通透性增加可导致微循环障碍，组织水肿，有效循环血容量下降，最终可能导致多器官功能障碍甚至死亡^[3]。到目前为止脓毒症中血管内皮细胞通透性增加的机体自身调节机制尚未完全阐明。

脓毒症时交感-肾上腺轴的激活可诱发交感神经兴奋，肾上腺髓质分泌大量嗜铬粒蛋白A(chromogranin A，CGA)，CGA是肾上腺髓质含量丰富的激素原蛋白之一。CGA具有多种生物学功能，如对心肌的负性调节作用，调节分泌小泡形成，参与高血压调节机制等^{[4, 5]}。CGA的NH₂-端CGA_1-76具有重要的心血管调节作用，同时CGA_1-76对TNF-α诱导的血管内皮细胞通透性增加具有一定的调节作用^{[6, 7]}。已知TNF-α引起血管内皮细胞通透性改变与诱导细胞外Ca²⁺内流密切相关，CGA_47-66 (chromofungin，CHR)作为CGA_1-76的重要功能基团，是否参与血管内皮细胞钙信号的调节而改变炎症状态下的血管通透性尚未有研究。本研究旨在明确CHR是否能够通过钙信号途径而影响TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞通透性增加。

人工合成多肽CHR由上海科肽生物科技有限公司合成(上海，中国)。人脐静脉内皮细胞株EA.hy926购买自上海汉恒生物有限公司(上海，中国)。胎牛血清、RPMI-1640培养基购买自Hyclone公司(洛根，美国)。钙离子荧光探针Fluo-3 AM、TMB显色液购买自上海碧云天生物技术有限公司(上海，中国)。重组人TNF-α、辣根过氧化物酶(HRP)购买自Sigma公司(阿宾顿，英国)。Transwell小室购买自Millipore公司(麻省，美国)。

EA.hy926细胞由含0.02% EDTA的0.25% 胰酶消化后种植于培养瓶内，加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

取300 μL密度为1×10⁵个/mL 的EA.hy926细胞悬液，接种于Transwell小室上室，培养24 h至细胞融合为单层。上室加入不同浓度CHR(10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L)预处理30 min后加入22 ng/mL TNF-α，培养24 h。PBS洗涤细胞3次，在上室加入含HRP(50 mg/L)的PBS 300 μL，下室加入PBS 300 μL，2 min后收集下室液体10μL/孔移至96孔板，加入200 μL TMB显色液。15 min后用酶标仪(波长490 nm)测定的吸光度A值即表示细胞相对通透性。 1.4 激光扫描共聚焦显微镜检测CHR对EA.hy926细胞[Ca²⁺]_i的影响

将EA.hy926细胞以1×10⁵个/mL密度接种于玻底培养皿，培养24 h。PBS洗涤细胞3次，钙离子荧光探针Fluo-3 AM(5 μmol/L)37 ℃孵育45 min。配制Hepes缓冲液(氯化钠140 mmol/L；氯化钾5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，EGTA 0.1 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，pH 7.0)。Hepes缓冲液洗涤细胞3次。分别观察CHR和TNF-α在不含Ca²⁺和含有2.5 mmol/L Ca²⁺的 Hepes液中对EA.hy926细胞内Ca²⁺的影响。同时，在正常EA.hy926细胞和TNF-α(22 ng/mL)作用下的EA.hy926细胞加入不同浓度CHR(10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L)观察细胞内Ca²⁺荧光强度的变化。用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)图像分析系统分析EA.hy926细胞内Fluo-3 AM荧光强度变化，得到反映[Ca²⁺]_i随时间变化的荧光强度动态曲线图，并比较各组不同时间点细胞内Ca²⁺荧光强度。

计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组均数进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和两两比较(Tukey)，Ca²⁺荧光强度分析采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。数据用SPSS 17.0软件进行分析，Sigmaplot 10.0进行作图。

与空白组比较，22 ng/mL TNF-α组EA.hy926细胞通透性明显增加[(1.189±0.086) vs .(1.77±0.195)，t=4.343，P=0.01]，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L CHR能够抑制TNF-α诱导的EA.hy926细胞通透性增加，其中10 nmol/L、100 nmol/L CHR组的细胞通透性比TNF-α组显著降低[(1.771±0.195) vs .(1.315±0.134)，t=3.403，P=0.042；(1.771±0.195) vs .(1.236±0.181)，t=3.985，P=0.017，图 1]。1 000 nmol/L CHR降低TNF-α诱导的EA.hy926细胞通透性增加，差异无统计学意义[(1.771±0.195) vs .(1.411±0.255)，t=2.679，P=0.126，图 1]。

A:空白组；B：TNF-α组；C：CHR 10 mol/L+TNF-α组；D：CHR 100 mol/L+TNF-α组；E：CHR 1 000 mol/L+TNF-α组；细胞相对通透性以( x ±s )表示;与空白组比较,aP=0.01；与TNF-α组比较,bP<0.05 图 1 CHR对TNF-α诱导的EA.hy926细胞高通透性的影响 Fig 1 The effect of CHR on TNF-α-induced hyperpermeability in EA.hy926 cell

图选项

在CLSM下获得EA.hy926细胞清晰的荧光图像，形态与白光下倒置显微镜所见一致。无论Hepes液中是否含Ca²⁺，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L CHR均未能引起EA.hy926细胞内[Ca²⁺]_i的荧光强度变化(图 2)。10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L CHR组各时间点细胞内Ca²⁺荧光强度F_t40、F_t100与起始荧光强度F_t30比较，差异无统计学意义(图 3)。

[Ca2+]o表示细胞外液中Ca2+浓度，[Ca2+]i表示细胞内液中Ca2+浓度 图 2 CHR对EA.hy926细胞[Ca2+]i的影响 Fig 2 The effect of CHR on [Ca2+]i in EA.hy926 cell

图选项

A：含Ca2+的Hepes缓冲液中，加入CHR后比较各时间点EA.hy926细胞内Ca2+荧光强度Ft30、Ft40和Ft100变化，；B：含2.5 mmol/L Ca2+的Hepes缓冲液中加入CHR后比较各时间点EA.hy926细胞内Ca2+荧光强度Ft30、Ft40和Ft100 变化。Ft30表示加入CHR时细胞内Ca2+荧光强度；Ft40表示加入CHR 10 s时细胞内Ca2+荧光强度；Ft100表示加入CHR 70 s时细胞内Ca2+荧光强度 图 3 EA.hy926细胞内各时间点Ca2+荧光强度比较 Fig 3 The comparison of Ca2+ fluorescence intensity at different intervals in EA.hy926 cell

图选项

在不含Ca²⁺的Hepes缓冲液中，22 ng/mL TNF-α不能诱导EA.hy926细胞内Ca²⁺荧光强度变化(图 4A)；在2.5 mmol/L Ca²⁺ 的Hepes缓冲液中，22 ng/mL TNF-α可以诱导EA.hy926细胞内Ca²⁺荧光强度明显增加，提示TNF-α引起细胞外Ca²⁺内流(图 4B)；在2.5 mmol/L Ca²⁺ 的Hepes缓冲液中，使用10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L CHR预处理30 min均可抑制TNF-α诱导的细胞内Ca²⁺荧光强度的增加(图 4 C，D，E)；10 nmol/L和1 000 nmol/L CHR组在后期随着时间的延长Ca²⁺荧光强度轻度增加(图 4 C，E)。TNF-α组各时间点细胞内Ca²⁺荧光强度F_t40、F_t100与起始荧光强度F_t30比较，差异具有统计学意义[荧光强度分别为：(41.497±3.788) vs .(56.193±3.082)，F=196.129，P=0.000；(41.497±3.788) vs .(53.457±4.536)，F=101.19，P=0.000，图 5]；10 nmol/L CHR+TNF-α、100 nmol/L CHR+TNF-α和1 000 nmol/L CHR+TNF-α组各时间点细胞内Ca²⁺荧光强度F_t40、F_t100与起始荧光强度F_t30比较，差异无统计学意义。

A：含Ca2+EA.hy926细胞Ca2+荧光强度的变化(A、B)以及不同浓度CHR对 TNF-α作用下的EA.hy926细胞Ca2+荧光强度变化的影响(C-E) 图 4 CHR对TNF-α诱导EA.hy926细胞Ca2+内流的影响 Fig 4 The effect of CHR on TNF-α-induced Ca2+ entry in EA.hy926 cell

图选项

A:TNF-α组；B：CHR 10 mol/L+TNF-α组；C：CHR 100 mol/L+TNF-α组；D：CHR 1 000 mol/L+TNF-α组；各组细胞在不同时间点Ca2+荧光强度Ft40、Ft100与起始荧光强度Ft30比较，aP<0.05 图 5 EA.hy926细胞内各时间点Ca2+荧光强度比较 Fig 5 The comparison of Ca2+ fluorescence intensity at different intervals in EA.hy926 cell

图选项

脓毒症和全身炎症反应时血管内皮的广泛激活和功能障碍直接破坏微血管屏障的完整性，引起组织水肿、休克甚至多器官功能衰竭^{[8, 9, 10]}。调节血管内皮细胞通透性，避免过度炎症反应引起血管内皮细胞损伤，是脓毒症中维持循环稳态、保护脏器功能的关键。

脓毒症时机体分泌多种炎症介质，比如TNF-α、血管内皮生长因子和组胺等，都能诱导血管内皮细胞损伤^[11]。TNF-α是脓毒症早期主要的促炎介质之一，作用于血管内皮细胞时诱导细胞外Ca²⁺内流，细胞内Ca²⁺浓度升高，导致细胞通透性增加^{[1, 12]}。

本实验研究结果表明10~1 000 nmol/L浓度范围的CHR能够抑制TNF-α 诱导的血管内皮细胞通透性增加，笔者前期研究也支持这一结果^[13]。Blois等^[7]研究证实CGA_1-76能够抑制TNF-α诱导的内皮通透性增加，但是具体机制尚未阐明。本研究结果显示10~1 000 nmol/L浓度范围的CHR对正常血管内皮细胞细胞内[Ca²⁺]_i没有影响，但是均能抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞外Ca²⁺快速内流，本研究结论能够进一步阐明CGA_1-76改善血管内皮细胞通透性的分子机制。

本实验研究表明10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L CHR组早期均有抑制TNF-α诱导血管内皮细胞外Ca²⁺内流的作用，但是随着时间的延长，10 nmol/L和1 000 nmol/L CHR这两组后期细胞内Ca²⁺荧光强度有所增加，其原因可能分别与低浓度CHR不能全部抑制TNF-α诱导Ca²⁺内流作用以及高浓度CHR的细胞毒性作用相关^[12]。已有研究表明CGA参与调节血管生成，调节血管通透性^[14]，笔者前期研究结果表明CGA和危重患者的预后密切相关^[15]，2012年Finland一项多中心随机大样本试验^[16]也证明了笔者这一前期研究结果。CGA的NH₂-端CGA1-76具有血管舒张效应、调节细胞黏附等多种生物学功能^{[17, 18]}。本研究结果表明CGA衍生多肽CHR通过钙信号机制参与到脓毒症时血管内皮细胞正常通透性的维持这一机体稳态调节的重要机制，这一研究结果也是对CGA和CGA的NH₂-端衍生多肽CGA_1-76重要生物学功能的进一步诠释，尤其阐明了其发挥这些重要作用的新的分子机制。

有意思的是笔者早期的研究发现CHR 在5 μmol/L及以上浓度时可诱导中性粒细胞外Ca²⁺内流作用 ^[19]，而本实验结果显示CHR在远远低于前者的浓度范围(10 nmol/L~1 000 nmol /L)可以抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞Ca²⁺内流，提示CHR和其他一些对生理功能具有双向调节作用的蛋白质(如凝血酶等^{[20, 21]})一样，随着浓度的变化而对机体生理功能可能具有双向调节作用。

本研究结果显示CHR能够改善TNF-α诱导的血管内皮细胞通透性增加，同时CHR也能抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞Ca²⁺内流。这一结果提示CHR可能通过抑制Ca²⁺这一与通透性相关的关键信号来改善TNF-α诱导血管内皮细胞通透性增加。

本研究首次从钙信号途径角度探讨了肾上腺髓质重要的应激激素前蛋白CGA衍生多肽CHR对炎症状态下血管内皮细胞通透性的影响，为进一步阐明脓毒症时神经内分泌免疫系统通过肾上腺髓质分泌的激素前蛋白维持微循环稳态的机制以及寻找脓毒症的治疗方法提供了新的思路。