2015, Vol. 24
福建医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系 福建医科大学神经生物学研究中心 福建省高校脑老化与神经变性疾病重点实验室(宋斌)
心搏骤停是非常严重的事件，病死率高。据报道心搏骤停患者出院存活率仅为6%~14%[1]，其重要原因是心肺复苏(CPR)后脑缺血-再灌注损伤。研究表明，心搏骤停后脑损伤占院外心搏骤停死亡的68%，占院内心搏骤停死亡的23%[2]。缺血后处理是指缺血-再灌注后立即短暂中断血流从而对脏器提供保护作用。实验发现，缺血后处理可以减轻心肺复苏后心肌损伤并改善心肌功能[3, 4]。目前，关于应用缺血后处理保护心肺复苏后脑缺血-再灌注损伤的研究极少。因此，本研究采用缓激肽延迟后处理对心搏骤停心肺复苏大鼠进行干预，观察其对神经功能的效应并初步探讨其可能作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组24只健康成年雄性SD大鼠，4月龄，体质量(300.7±10.6) g，由福建医科大学实验动物中心提供[动物许可证号：SYXK(闽2012-0001)]；由福建医科大学实验动物中心生产的普通颗粒饲料，新鲜自来水进行喂养；室温控制在18～24 ℃，湿度控制在45%～65％。
用随机数字表法将大鼠分成3组，每组8只。(1)假手术组(Sham组)： 仅给予大鼠动静脉置管和气管插管机械通气等一般操作，未用窒息法诱导心脏骤停。(2)心搏骤停后自主循环恢复(ROSC)组： 窒息法诱导心搏骤停，经心肺复苏后ROSC并存活2 d后腹腔注射等体积无菌生理盐水。(3)缓激肽后处理组(BR-P组)：同法构建ROSC模型，经心肺复苏存活2 d后腹腔注射缓激肽(150 μg/kg)。心肺复苏后3 d，统计各组大鼠病死率并补充例数。
1.2 方法 1.2.1 窒息法诱导建立心搏骤停模型术前大鼠禁食12 h，采用4.5%戊巴比妥钠以45 mg/kg浓度进行腹腔注射麻醉。在直视下经口用14号套管行气管插管。从左侧股动脉置入23号PE-50聚乙烯管到胸主动脉，连接压力传感器至RM-6280多导生理记录仪(成都仪器厂,中国)用于监测主动脉血压，所有导管均充满5 U/mL肝素生理盐水。动物进行机械通气，吸入氧体积分数为21%，潮气量为6.5 mL/kg体质量，呼吸频率100次/min。
记录血压、呼吸及心率等，待基线稳定后经股动脉快速推注维库溴胺(2 mg/kg)，并用肝素盐水快速冲管。观察血压波形并记录肌松剂推注后呼吸停止时间和心搏停止时间，以主动脉血压失去波动波形且平均动脉压降至20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以下作为心搏停止的判断标准[5]。
1.2.2 心肺复苏心搏停止6 min后开始胸外按压和连接DH-150动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器公司，中国)进行机械通气。按压频率为200次/min，通气频率为100次/min,按压深度为胸廓前后径的1/3，间断推注肾上腺素(0.01 mg/min)。ROSC标准:室上性自主心律恢复及平均动脉血压≥60 mmHg并维持10 min以上。10 min内未能ROSC则放弃复苏。于大鼠ROSC后2 h撤机械通气，拔除气管鞘管并吸痰，拔除股动脉置管，切口局部缝合，安尔碘消毒，肌肉注射0.4 g头孢他啶抗感染，待大鼠苏醒可自由活动后将其回笼观察。
1.2.3 神经功能缺损评分(neurological deficit scores,NDS)心肺复苏后3 d，分别对3组大鼠进行NDS评分，采用Jia等[3]的方法从整体行为、脑干功能、肌张力评分、感觉评分、运动评分、行为学评分及癫痫发作共7个方面评估脑损伤程度，总分80分为正常，0分为脑死亡。
1.2.4 免疫荧光双标染色心肺复苏后3 d，三组大鼠均在麻醉后灌注固定取脑。将脑组织置于梯度蔗糖中脱水至沉底修块后，以HM-525冰冻旋转切片机(Microm International GmbH，德国)行脑组织冰冻切片，片厚20 μm。对照第五版大鼠脑立体定位图谱，选取经过海马CA1区的同一冠状面切片，分别进行DAPI/Bax、Bcl-2、Caspase-3免疫荧光双标染色。
以马血清(s-2000，美国Vector labs)封闭切片后，分别滴加均为1∶ 100浓度的一抗Bax(ab7977，美国Abcam)、Bcl-2(ab7973，美国Abcam)、Caspase-3(ab44976，美国Abcam)各20 μL，4 ℃过夜。加入浓度为1∶ 500的Alexa Fluor 488驴抗兔绿色荧光标记Ig二抗(A21206，美国Introgen)各20 μL，37 ℃避光孵育45 min。滴加浓度为5 μg/mL 的DAPI(中国Beotime)各20 μL，避光反应5 min。以防荧光淬灭封片液封片,TCS SP5激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)下观察各组CA1区神经元细胞核形态。运用Leica AF Lite软件以平均吸光度值半定量分析各组间 CA1区 Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白水平表达差异。
1.3 统计学方法运用SPSS 20.0 for Windows软件进行资料的统计分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，均通过正态性检验。多组间的差异以单因素ANOVA检验进行分析，两组间的比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组基线指标及复苏结果Sham组、ROSC组和BR-P组间的各项基线指标，经整体分析(单因素方差分析)及两两多重比较(LSD-t检验及χ2检验)，差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示3组的非处理因素均大致平衡，有试验的可比性。见表 1。
| 组别 | n | 体质量 (g) | 心率 (次/min) | 呼吸 (次/min) | 收缩压(mmHg) | 舒张压 (mmHg) | 复苏成功率 (%) |
| Sham组 | 8 | 298±15 | 323±22.3 | 83.0±6.8 | 149.0± 8.9 | 110.0±5.7 | - |
| ROSC组 | 8 | 303±23 | 336±19.8 | 86.0±8.4 | 153.0±12.6 | 120.0±9.9 | 72.7 |
| BR-P组 | 8 | 301±11 | 344±30.1 | 81.0±9.5 | 147.0±10.2 | 108.0±8.8 | 72.7 |
| 整体分析 | F值，P值 | 0.327，0.725 | 1.700，0.207 | 0.729，0.494 | 0.670，0.522 | 4.873，0.018 | |
| S vs. R | LSD-t，P | 0.778，0.445 | 1.105，0.282 | 0.692，0.497 | 0.724，0.477 | 2.407，0.025 | |
| S vs. B | LSD-t，P | 0.198，0.845 | 1.831，0.081 | 0.511，0.615 | 0.420，0.679 | 0.518，0.610 | |
| R vs. B | LSD-t，P | 0.580，0.568 | 0.726，0.476 | 1.203，0.242 | 1.144，0.265 | 2.925，0.008 | -，1.000 |
| 注：Sham组 假手术组；ROSC组 自主循环恢复组；BR-P组 缓激肽后处理组；复苏成功率的比较为精确概率检验，其他为单因素方差分析+LSD多重比较 | |||||||
心肺复苏后3 d各组NDS评分列示于表 2。整体分析及两两比较显示，差异均有统计学意义(P<0.05)。ROSC组(60.1±6.5)及BR-P组(69.8±3.4)NDS评分均低于Sham组(80.0±0.0)。提示ROSC组及BR-P组神经功能较假手术组均减退，而BR-P组较ROSC组有所改善。
| 组别 | n | DNS评分 | Bax/DAPI | Bcl-2/DAPI | Caspase-3/DAPI |
| Sham组 | 8 | 80.0±0.0 | 37.4±4.2 | 47.5±2.7 | 37.3±4.1 |
| ROSC组 | 8 | 60.1±6.5 | 56.7±5.8 | 41.9±4.0 | 43.5±4.7 |
| BR-P组 | 8 | 69.8±3.4 | 51.3±5.2 | 46.0±4.7 | 38.9±2.7 |
| 整体分析 | F值，P值 | 44.314，0.000 | 30.197，0.000 | 4.502，0.024 | 5.459，0.012 |
| S vs. R | LSD-t，P | 9.413，0.000 | 7.536，0.000 | 2.906，0.008 | 3.181，0.004 |
| S vs. B | LSD-t，P | 4.824，0.000 | 5.413，0.000 | 0.806，0.429 | 0.816，0.424 |
| R vs. B | LSD-t，P | 4.589，0.000 | 2.123，0.046 | 2.100，0.048 | 2.365，0.028 |
在DAPI染色下，神经元胞核呈蓝色。与Sham组比较，ROSC组CA1区可见较多神经元细胞胞核染色质固缩、向外周聚集、形成周边化，甚至破裂形成碎片，提示细胞凋亡。BR-P组凋亡细胞较ROSC组有减少趋势(图 1)。
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| 心肺复苏后3 d，各组海马CA1区神经元细胞凋亡情况比较；A：Sham组；B：ROSC组；C：BR-P组 图 1 各组大鼠海马CA1区DAPI染色图片(×200) Fig.1 DAPI staining of hippocampus CA1 region of rats in each group (×200) |
对各组海马CA1区Bax/DAPI免疫荧光双标染色资料进行了比较。整体分析及两两比较显示均差异具有统计学意义(P<0.05)。ROSC组Bax蛋白荧光强度(56.7±5.8)较Sham组(37.4±4.2)增强；而BR-P组Bax蛋白荧光强度(51.3±5.2)则较ROSC组减弱。见表 2及图 2。
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| 心肺复苏后3 d，各组间大鼠海马CA1区Bax蛋白表达情况比较；A：Sham组；B：ROSC组；C：BR-P组 图 2 各组大鼠海马CA1区Bax/DAPI免疫荧光双标染色图片(×200) Fig.2 Bax/DAPI double immunofluorescence staining of hippocampus CA1 region of rats in each group (×200) |
同前方法，对各组海马CA1区Bcl-2/DAPI免疫荧光双标染色资料进行了比较。整体分析显示差异具有统计学意义(P<0.05)，两两比较也提示ROSC组和另外两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。ROSC组Bcl-2蛋白荧光强度(41.9±4.0)较Sham组(47.5±2.7)减弱；而BR-P组Bcl-2蛋白荧光强度(46.0±4.7)则较ROSC组增强。见表 2及图 3。
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| 心肺复苏后3 d，各组间大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白表达情况比较；A：Sham组；B：ROSC组；C：BR-P组 图 3 各组大鼠海马CA1区Bcl-2/DAPI免疫荧光双标染色图片(×200) Fig.3 Bcl-2/DAPI double immunofluorescence staining of hippocampus CA1 region of rats in each group (×200) |
各组海马CA1区Caspase-3/DAPI免疫荧光双标染色资料的变化趋势，大体上和Bcl-2/DAPI资料相反，整体分析及ROSC组与其他组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，但ROSC组水平最高，达(43.5±4.7)，分别高于Sham组( 37.3±4.1)、BR-P组(38.9±2.7)。提示ROSC组Caspase-3蛋白表达呈增强态势。见表 2及图 4。
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| 心肺复苏后3 d，各组间大鼠海马CA1区Caspase-3蛋白表达情况比较；A：Sham组；B：ROSC组；C：BR-P组 图 4 各组大鼠海马CA1区Caspase-3/DAPI免疫荧光双标染色图片(×200) Fig.4 Caspase-3/DAPI double immunofluorescence staining of hippocampus CA1 region of rats in each group (×200) |
本研究表明，心肺复苏后大鼠海马CA1区神经元凋亡明显，神经功能缺陷显著，给予缓激肽后处理干预后明显减少神经元凋亡，神经功能也明显改善。进一步通过免疫荧光技术发现，缓激肽后处理明显减少Bax和Caspase-3蛋白表达，同时增强Bcl-2蛋白表达，这些提示缓激肽后处理可能通过抑制神经元凋亡从而改善复苏后神经功能。
心搏骤停和心肺复苏后引起脑损伤的机制复杂，包括谷氨酸兴奋毒性、钙内环境稳态改变、自由基形成[4]、病理性蛋白酶级联和激活细胞凋亡途径，其中细胞凋亡是脑缺血-再灌注致迟发性神经元死亡主要机制，这在大脑海马特别是CA1区神经元表现尤为显著。Bcl-2和Bax均是细胞凋亡相关蛋白，Bcl-2蛋白表达上调可对抗细胞凋亡，Bax蛋白表达上调可促进细胞凋亡[5, 6]。Bax同属Bcl-2家族，可与Bcl-2结合形成异二聚体，两者水平的比例变化决定既定部位细胞是否发生凋亡及其凋亡严重程度，在细胞凋亡的调节中起重要作用。Caspase-3在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，在细胞凋亡过程中起非常重要的作用[7]。在细胞凋亡早期阶段，Caspase-3被激活，裂解相应的胞质、胞核底物。在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3活性明显下降。本实验结果发现心肺复苏后大鼠海马CA1区Bax和Caspase-3蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达减弱，同时存在显著的细胞凋亡，这与之前的研究是一致的[8, 9, 10]。如何减少神经元凋亡是目前研究的热点。最近，缺血后处理保护神经细胞引起研究者的关注。
缺血后处理是指缺血-再灌注后简短中断血流可提供保护作用。作为一种新的内源性保护策略，后处理与预处理类似，可减轻再灌注损伤的多个表现。在最初的麻醉犬的冠状动脉阻塞再灌注研究显示，三次循环的冠状动脉灌注交替30 s再阻塞明显降低梗死面积和内皮功能紊乱[11]。研究同样显示显示缺血或其他有害因素后处理可减轻局部脑缺血后脑梗死面积和保护全身缺血后神经元损害[8]。后处理的保护机制包括抑制凋亡、减轻炎症反应、降低氧化应激和保护线粒体通透转位孔(mPTP)开放等[9, 12, 13]。
后处理根据干预措施应用时间可分为快速后处理(再灌注后即刻或数分钟内)及延迟后处理(再灌注后数小时或数天)。关于快速后处理对缺血-再灌注后神经元保护仍存在争议，有研究结果显示快速后处理并未呈现足够神经保护效应[14, 15]，而延迟后处理在多个研究中被证实可起神经保护效应[16, 17, 18, 19]，这可能与全身性脑缺血后，脑部尤其海马区存在迟发性神经元死亡有关[20, 21]，这为后处理的临床应用提供了更强的可操作性。因此，本研究缓激肽后处理时间点选择在ROSC后48 h。
缓激肽(bradykinin)是由激肽释放酶-激肽系统激活释放的一种内源性九肽，主要通过激活β2受体引起神经元破坏和血脑屏障功能障碍，而β1受体主要介导轴突损伤及炎症[22]。病理情况下，缓激肽参与星形胶质细胞炎症介质产生和小胶质细胞激活，因此可增加血管通透性及开放血脑屏障。证据表明脑缺血和创伤后，缓激肽介导继发性脑损害[23, 24]。缓激肽激活β2受体释放花生四烯酸和激活环氧合酶，也能刺激兴奋性氨基酸神经递质释放，诱导产生NO和增加细胞内钙水平。但是，这些介质也可通过后处理保护脑。在缺血性脑卒中晚期，转移激肽释放酶基因提供了神经保护，抑制了脑缺血损伤，β2受体参与了该过程。Danielisova等[25]对短暂前脑缺血大鼠研究，也发现缓激肽后处理可保护脑缺血损伤和促进神经元存活。本实验中，缓激肽后处理干预后，大鼠海马CA1区Bax和Caspase-3蛋白表达明显减弱，Bcl-2蛋白表达增强，同时细胞凋亡显著减少，进一步证实缓激肽后处理的神经保护效应。
综上所述，缓激肽后处理可减轻神经元凋亡，这可能与其减弱Bax、Caspase-3蛋白表达，增强Bcl-2蛋白表达，从而抑制内源性细胞凋亡途径有关。
| [1] | 廖晓星. 心搏骤停后的脑保护策略[J]. 中华急诊医学杂志, 2010, 19(1): 7-10. |
| [2] | Laver S, Farrow C, Turner D, et al. Mode of death after admission to an intensive care unit following cardiac arrest[J]. Intensive Care Med, 2004, 30(11): 2126-2128. |
| [3] | Jia X, Koenig MA, Nickl R, et al. Early electrophysiologic markers predict functional outcome associated with temperature manipulation after cardiac arrest in rats[J]. Crit Care Med, 2008, 36(6): 1909-1916. |
| [4] | 王合金, 高占良, 何建凡, 等. 依达拉奉对心肺复苏小鼠脑的保护作用[J].中华急诊医学杂志, 2013, 22(8): 870-872. |
| [5] | 何婧瑜, 王晶, 关云谦, 等. 胰岛素对心肺复苏大鼠神经元凋亡及Bcl-2,Bax mRNA表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2011, 20(10): 1056-1061. |
| [6] | Liu G, Wang T, Wang T, et al. Effects of apoptosis-related proteins caspase-3, Bax and Bcl-2 on cerebral ischemia rats[J]. Biomed Rep, 2013, 1(6): 861-867. |
| [7] | Li J, Han B, Ma X, et al. The effects of propofol on hippocampal caspase-3 and Bcl-2 expression following forebrain ischemia-reperfusion in rats[J]. Brain Res, 2010, 1356: 11-23. |
| [8] | 詹丽英, 赵博,夏中元. 缺血后处理减轻脑皮质缺血-再灌注损伤[J]. 中华急诊医学杂志, 2012, 21(2): 171-174. |
| [9] | Joo SP, Xie W, Xiong X, et al. Ischemic postconditioning protects against focal cerebral ischemia by inhibiting brain inflammation while attenuating peripheral lymphopenia in mice[J]. Neuroscience, 2013, 243: 149-157. |
| [10] | Yuan Y, Guo Q, Ye Z, et al. Ischemic postconditioning protects brain from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway[J]. Brain Res, 2011, 1367: 85-93. |
| [11] | Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning[J]. AmJPhysiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2): H579-588. |
| [12] | Zhang W, Miao Y, Zhou S, et al. Neuroprotective effects of ischemic postconditioning on global brain ischemia in rats through upregulation of hippocampal glutamine synthetase[J].JClin Neurosci, 2011, 18(5): 685-689. |
| [13] | Yang Z, Chen Y, Zhang Y, et al. Sevoflurane postconditioning against cerebral ischemic neuronal injury is abolished in diet-induced obesity: role of brain mitochondrial KATP channels[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(3): 843-850. |
| [14] | Gao X, Ren C,Zhao H. Protective effects of ischemic postconditioning compared with gradual reperfusion or preconditioning[J].JNeurosci Res, 2008, 86(11): 2505-2511. |
| [15] | Xing B, Chen H, Zhang M, et al. Ischemic post-conditioning protects brain and reduces inflammation inarat model of focal cerebral ischemia/reperfusion[J].JNeurochem, 2008, 105(5): 1737-1745. |
| [16] | Danielisova V, Gottlieb M, Nemethova M, et al. Bradykinin postconditioning protects pyramidal CA1 neurons against delayed neuronal death in rat hippocampus[J]. Cell Mol Neurobiol, 2009, 29(6/7): 871-878. |
| [17] | Bonova P, Burda J, Danielisova V, et al. Delayed post-conditioning reduces post-ischemic glutamate level and improves protein synthesis in brain[J]. Neurochem Int, 2013, 62(6): 854-860. |
| [18] | Burda R, Danielisova V, Gottlieb M, et al. Delayed remote ischemic postconditioning protects against transient cerebral ischemia/reperfusion as well as kainate-induced injury in rats[J]. Acta Histochem, 2014, 116(6): 1062-1067. |
| [19] | Danielisova V, Burda J, Nemethova M, et al. An effective combination of two different methods of postconditioning[J]. Neurochem Res, 2012, 37(10): 2085-2091. |
| [20] | Yu Q, Guo Z, Liu X, et al. Block of P2X7 receptors could partly reverse the delayed neuronal death in area CA1 of the hippocampus after transient global cerebral ischemia[J]. Purinergic Signal, 2013, 9(4): 663-675. |
| [21] | Jiao L, Zhang J, Li Z, et al. Edaravone alleviates delayed neuronal death and long-dated cognitive dysfunction of hippocampus after transient focal ischemia in Wistar rat brains[J]. Neuroscience, 2011, 182: 177-183. |
| [22] | Albert-Weissenberger C, Stetter C, Meuth SG, et al. Blocking of bradykinin receptor B1 protects from focal closed head injury in mice by reducing axonal damage and astroglia activation[J].JCereb Blood Flow Metab, 2012, 32(9): 1747-1756. |
| [23] | Raslan F, Schwarz T, Meuth SG, et al. Inhibition of bradykinin receptor B1 protects mice from focal brain injury by reducing blood-brain barrier leakage and inflammation[J].JCereb Blood Flow Metab, 2010, 30(8): 1477-1486. |
| [24] | Dobrivojevic M, Spiranec K,Sindic A. Involvement of bradykinin in brain edema development after ischemic stroke[J]. Pflugers Arch, 2015, 467(2): 201-212. |
| [25] | Danielisova V, Gottlieb M, Nemethova M, et al. Effects of bradykinin postconditioning on endogenous antioxidant enzyme activity after transient forebrain ischemia in rat[J]. Neurochem Res, 2008, 33(6): 1057-1064. |