2015, Vol. 24
中山大学孙逸仙纪念医院急诊科(郭天柱、郑韶欣、侯婧瑛、周长青、龙会宝、钟婷婷、王彤)
近些年来，在成年的心脏组织中发现存在能自我分化和增值的心肌干细胞(cardiac stem cells，CSCs)[1, 2, 3]。且有较多研究证实心肌干细胞能向心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞分化[4]。且动物实验和临床研究均证实CSCs治疗心肌梗死能明显地改进心肌梗死后的心功能不全[5, 6, 7, 8]。但心肌干细胞用于心血管疾病的治疗也同样面临着安全性和心律失常方面的担心[9]。笔者前期研究对此进行了初步的探索，观察CSCs移植治疗心梗后6周大鼠的心电生理学特性和室颤阈值，发现CSCs移植后6周能明显改善心衰大鼠梗死边缘区的心电生理学稳定性和室颤阈值[10]。本研究是上述实验的延续和深入，试图与研究最为成熟，也被较早和较多用于心血管疾病治疗的骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)进行比较，观察CSCs和MSCs移植治疗后对梗死边缘区心电生理学稳定性及室颤阈值的影响有何不同。
1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂 1.1.1 实验动物新生3dSPF级Sprague-Dawley (SD) 雄性大鼠10只，用于CSCs分离、培养；1月龄清洁级健康雄性SD大鼠10只，用于MSCs分离、培养； 6月龄清洁级健康雄性SD大鼠30只，体质量(250±25) g，用于制备心肌梗死模型，上述动物均由中山大学动物实验中心提供。模型制备成功后，随机(随机数字法)分为3组，CSCs实验组、MSCs实验组、PBS对照组，每组10只大鼠。
1.1.2 主要试剂及设备IMDM培养液(Sigma，美国)；胰蛋白酶(Mediatech，美国)；胶原酶Ⅱ(Worthington Biochemical，美国)；Ca2+-Mg2+-free PBS(Cambrex，美国)；PKH26(Sigma，美国)；一抗缝隙连接蛋白43(Abcam，美国)；荧光二抗(Molecular Probes，美国)；HX-300S型呼吸机(泰盟科技有限公司，中国)；Smart型除颤仪(Philips，美国)；DF-6A程序电刺激器(东方电子仪器厂，中国)；室颤诱发器(Weil危重症研究所，美国)；BIOPAC SYSTEMS MAPl50电生理信号采集分析系统(Goleta，美国)；激光共聚焦显微镜(Nikon，日本)。
1.2 方法 1.2.1 大鼠心肌梗死模型的制备采用开胸直视下结扎左前降支冠状动脉方式制备心肌梗死模型，详见笔者课题组其他文献[10, 11]。左前降支冠状动脉缝扎成功的标记是肢体心电图ST 段明显抬高，QRS波宽大畸形。如有VF发生，立即胸外按压或使用2 J的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。
1.2.2 心肌干细胞的的分离、培养、传代和标记取新生后第3天的新生SD雄性大鼠心脏，采用组织培养法分离培养心肌干细胞，详见笔者课题组其他文献[10]。所有用于动物实验的细胞均为第3代细胞。实验用细胞均经PKH26染色后再移植。
1.2.3 骨髓间充质干细胞的分离、培养、传代和标记取1月龄SD大鼠的股骨和胫骨，采用全骨髓培养法分离培养骨髓间充质干细胞，详见本课题组其他文献[11, 12, 13]。所有用于动物实验的细胞均为第3代细胞。实验用细胞均经PKH26染色后再移植。
1.2.4 CSCs和 MSCs移植动物模型制备成功2周后，动物重新麻醉。行气管插管。随后实验组及对照组动物进行第2次开胸手术并分别接受0.1 mL PKH26标记的5×106 CSCs、0.1 mL PKH26标记的5×106 MSCs、0.1 mL等量的PBS从梗死心肌局部注射。其余与模型制备阶段相同。
1.3 观察指标 1.3.1 单极电图的记录标测电极(正极)置于心外膜梗死边缘区，参考电极(负极)置于皮下，电极连接生物信息采集系统，分别记录各区单极电图。心电数据通过生物信息记录系统记录于电脑。取窦性心律时段，测量单极电图激动恢复时间(activation recovery time，ART)与计算激动恢复时间离散度(ART dispersion，ARTd)。并且通过Bazett方程校正 (ARTc=ART/square root from RR)得到：校正激动恢复时间(ARTc)和校正激动恢复时间离散度(ARTcd)。ART是单极电图QRS波斜率最少值与单极电图T波斜率最大值之间的时间间隔，ARTd是同一只大鼠ART最大值与最少值之差[14]。
1.3.2 恶性心律失常的诱发梗死边缘区的程序电刺激包括S1S2、S1S2S3和Burst 刺激，由DF-6A程序电刺激器进行评估。S1S2为一个周期的长度为120 ms共8次基础刺激和1次额外刺激；S1S2S3为1个周期的长度为120 ms共8次基础刺激和2次额外刺激。Burst 刺激为在周期长度为1 s的时间内执行100/90/80/70/60/50 ms的程序刺激。在刺激的同时，ECG被1个频率为0.05~500 Hz 的ECG多通道放大器记录并储存在电生理采集系统计算机中。同一只大鼠，在梗死边缘区任何程序刺激下，诱发出室性心动过速和/或心室颤动视为诱发恶性室性心律失常成功。
1.3.3 室颤阈值测定使用美国危重病研究所研制的室颤诱发器[15]，在梗死边缘区给予频率为30 Hz，每次脉冲长度为10 ms总长为500 ms的电刺激，电流由1 mA开始逐渐增加，每次增加1 mA，在两次刺激之间给予2 min的间隔，直到两次均能诱发出室颤的最低电流为止。
1.3.4 组织免疫荧光检测采集电生理数据后，取出心脏，行冰冻切片，在梗死边缘区切取5 μm厚的切片做组织免疫荧光染色。分别检测CSCs和MSCs及缝隙连接蛋白43。
1.4 统计学方法计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 10.0处理数据，组间比较采用方差分析(SNK-q检验)，两独立配对样本的资料采用Student’ s 双尾t 检验。所诱发的恶性心律失常的次数采用Fisher 精确检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 单极电图激动恢复时间、纠正的激动恢复时间测定结果CSCs组、MSCs组及对照组的激动恢复时间、纠正的激动恢复时间在梗死边缘区的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图 1、图 2。
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| 图 1 三组大鼠单极电图梗死边缘区的激动恢复时间比较 Fig.1 Unipolar electrograms activation recovery time |
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| 图 2 三组大鼠单极电图梗死边缘区校正的激动恢复时间比较 Fig.2 Comparison of corrected activation recovery time in unipolar electrograms among three groups |
三组纠正的激动恢复时间离散度比较，CSCs组与MSCs组及对照组比较均差异具有统计学意义(P<0.05)，而MSCs组与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图 3。
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| 与PBS组比较，aP<0.05；与MSCs组比较，bP<0.05 图 3 三组大鼠单极电图校正的激动恢复时间离散度比较 Fig.3 Comparison of corrected activation recovery time dispersion in unipolar electrograms among three groups |
对照组在总共81次的程序电刺激中诱发出21次恶性心律失常，MSCs组在总共77次的程序电刺激中诱发出23次恶性心律失常，CSCs组在总共83次的程序电刺激中诱发出4次恶性心律失常，CSCs组与MSCs组及对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，而MSCs组与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图 4。
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| 与PBS组比较，aP<0.05；与MSCs组比较，bP<0.05 图 4 三组大鼠恶性心律失常的诱发率比较 Fig.4 Comparison of induced malignant ventricular arrhythmias among three groups |
三组在梗死边缘区的室颤阈值对比，CSCs组与MSCs组及对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，而MSCs组与PBS组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图 5。
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| 与PBS组比较，aP<0.05；与MSCs组比较，bP<0.05 图 5 三组大鼠不同区域的室颤阈值比较 Fig.5 Comparison of ventricular fibrillation threshold (mA) among three groups |
经激光共聚焦显微镜检测，大鼠心肌梗死边缘区可见红色 PKH26 标记的 CSCs 及 MSCs 存在，CSCs 组可以检测到绿色荧光标记的缝隙连接蛋白43。此外，可见CSCs分别与缝隙连接蛋白43荧光定位存在重叠，而 MSCs 组很少检测到绿色荧光标记的缝隙连接蛋白43(见图 6)。
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| A：PKH26标记的CSCs为红色；B：CSCs表达缝隙连接蛋白43为绿色；C：DAPI核染色为蓝色；D：A、B、C融合后显示CSCs表达连接蛋白43；E：PKH26标记的MSCs为红色；F：MSCs几乎不表达缝隙连接蛋白43；G：DAPI核染色为蓝色； H：E、F、G融合后显示MSCs罕有表达连接蛋白43 图 6 CSCs 组和MSCs 组检测缝隙连接蛋白43表达情况(激光共聚焦显微镜，×1 000) Fig.6 CSCs expressed Connexin-43 and α-sarcomeric actin(confocal laser scanning microscope images,×1 000) |
在心肌梗死后，出现了如下几个方面的改变：①因凋亡和坏死所引起的心肌细胞数量减少；②炎症细胞浸润和炎症因子的释放；③心梗后的心肌纤维化。这些变化导致了心室异质性，进而导致了心电生理的不稳定和室性心律失常的发生[16]。干细胞治疗心血管疾病最主要的担心也就是是否引起或加重恶性心律失常，包括室性心动过速和室颤[17]。干细胞治疗导致恶性心律失常发生的可能机制为：①干细胞内源性电生理学特性与移植宿主的细胞电生理学特性存在差异；②改变了离子通道的特性；③改变移植物和宿主或移植物和移植物的电生理学偶联；④改变了心脏本身的结构；⑤心肌局部注射所引起的炎症损伤和水肿；⑥导致异质性的发生[18]。
MSCs从骨髓中分离和培养得来，研究证实MSCs能在体外和体内分化为心肌细胞[19]。MSCs通过静脉、左心室、冠状动脉、梗死心肌部位的心外膜、心内膜等途径注射，在体内分化为心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞等，从而改善心梗后的心功能[19]。但也有研究认为MSCs移植治疗后虽然能够表达心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞的标记，但不能产生有功能并有正常搏动的心肌细胞[20]。在电生理学方面，由MSCs分化而来的心肌细胞显示出与成熟的心肌细胞不同的电生理特性。一些实验已经证实这些电生理的异质性导致了心律失常发生的可能[21]。但更多的动物和人类研究均认为MSCs移植并没有带来或导致恶性心律失常的增加[22]。本研究亦揭示与对照组比较，MSCs的心电生理学稳定性和室颤阈值并不比对照组差，但结果提示MSCs组在心电生理学稳定性和室颤阈值方面也没有优于对照组。
CSCs存在于宿主的心脏中，程序性地分化为心脏组织，如心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞[4]。动物实验和临床研究均证实CSCs能改进受损后的左室功能[4]。在电生理学方面，由CSCs分化而来的心肌细胞显示出同质性和成熟的心肌细胞表型[23]，并能与宿主的心肌细胞偶联[24]。本研究显示CSCs在梗死边缘区纠正的激动恢复时间离散度、电刺激所诱发的恶性心律失常、室颤阈值等方面明显比MSCs和PBS要好，说明CSCs来源于心脏，很可能适应于心肌细胞系定向分化的命运[4]。
缝隙连接蛋白43对于维持心肌细胞正常电偶联、心脏正常电活动以及协调舒缩的具有重要作用[25]。研究表明，缝隙连接蛋白43 与心肌梗死后心力衰竭及心律失常的发生发展密切相关[26]。本研究显示了CSCs在梗死边缘区有较多的Cx43表达，而MSCs在梗死边缘区罕有Cx43表达，也从另一侧面说明CSCs在心电生理学稳定性和室颤阈值方面比MSCs组和PBS组优越的原因，但具体的机制有待进一步探讨。
综上所述，CSCs移植和MSCs移植治疗心肌梗死是比较安全有效的，无明显致心律失常性。CSCs移植后6周其心电生理学稳定性改善和室颤阈值提高的效应较MSCs优越，CSCs是治疗心血管疾病较为理想的种子细胞。
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