急性肺损伤及其重症形式急性呼吸窘迫综合征是发生肺部的一种重症炎症反应，是导致重症患者发生呼吸衰竭的主要原因。它们能够引起肺泡破损并导致不同程度的通气灌注不足、严重低氧血症、肺顺应性差及非心源性肺水肿^[1]。急性肺损伤可能由多种病因导致，包括败血症、肺炎及输血相关的外伤等。其中败血症(尤其是革兰阴性菌导致引起的)是导致急性肺损伤的主要原因之一^[2]。目前，对于急性肺损伤的患者来说，并没有很好的治疗的方法，通常需要采取呼吸支持来进行处理^[3]。尽管近年来在呼吸支持系统上取得了一些进步，但是由急性肺损伤(不同病因导致)引起的死亡仍有约40%左右^[1]。因此有必要去研究寻找治疗急性肺损伤的方法。近年来的研究发现，间充质干细胞(MSCs)作为一种成体干细胞，能够进行自我更新及多向分化^[4]。它们可以从多种成体组织中进行分离获得，并且能够在体外进行扩增培养。此外，间充质干细胞还具有免疫耐受的特性^[5]，这为它们进行移植治疗提供了便利。近年来的有研究证实，骨髓来源的间充质干细胞能够缓解脂多糖引起的急性肺损伤^{[6, 7, 8]}，但对于MSCs在急性肺损伤中的治疗效应的相关机制并未深入研究。Wnt/β-Catenin信号通路在组织损伤修复、伤口愈合、组织纤维化、组织重构及破坏中发挥着重要的作用^[9]。一些研究证实Wnt/β-Catenin信号失调与多种疾病的发生发展有关，包括有哮喘、肺纤维化^[10]、慢性阻塞性肺气肿^[11]及肺癌^[12]。此外，Wnt/β-Catenin信号被认为还参与到间充质干细胞的分化过程中，其中就包括有间充质细胞向上皮细胞的分化^[13]。而这种对间充质干细胞向上皮细胞调控的过程可能参与到了肺损伤的修复及肺纤维化的过程中。本研究通过体外培养骨髓间充质干细胞同时建立急性肺损伤的模型，来探讨Wnt/β-Catenin信号的组成成分在急性肺损伤中的作用。

6 只3周龄SPF 级雄性SD 大鼠,体质量60 g；72 只6 周龄SPF 级雄性SD 大鼠,体质量180~220 g。购自第二军医大学实验动物中心。在标准动物饲养间内，给予无菌水和食物饲养。

无血清低糖DMEM、胎牛血清购自美国ScienCell公司。O55:B5剂型的LPS购自Sigma公司。Wnt1、Wnt 5a单克隆抗体及抗体p-GSK-3β、GSK-3β及β-catenin均购自Abcam 公司；Wnt 3a单克隆抗体购自Cell signalling公司；蛋白裂解液购自碧云天公司；BCA蛋白定量试剂盒、化学分光底物、苏木精-伊红购自北京化学试剂公司。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

采用贴壁法分离培养MSCs，方法如前文所述。简述如下：将大鼠经断颈处死后，无菌分离股骨和胫骨。采用注射器将骨髓从骨髓腔内冲出，收集悬液通过离心沉淀。采用无血清低糖DMEM洗涤两次后，采用含20%胎牛血清的低糖DMEM并将细胞置于37 ℃ 5%CO₂的条件下进行培养。细胞的表型鉴定采用流式细胞仪进行。收集4~5代的细胞用于急性肺损伤的治疗。

总共72只大鼠随机(随机数字法)分成4组，每组18只。具体分组如下：Control组经右侧尾静脉组织0.4 mL PBS；LPS 组经右侧尾静脉注射8 mg/kg细菌脂多糖(LPS)；LPS+MSC组经右侧尾静脉注射8 mg/kg细菌脂多糖(LPS)之后，再经左侧注射1× 10⁶个MSCs；Control+MSC组经右侧尾静脉组织0.4 mL PBS之后，再经左侧注射1× 10⁶个MSCs。在模型建立后的6 h、24h及48 h分别处死大鼠用于后续的分析。

将新鲜分离的肺组织经PBS洗涤去除残留血块后进行称量，计作湿质量。随后将肺组织经80 ℃烤箱烘烤至恒重再次进行称量，计作干质量。两者的比值即为肺湿干比。

通过一次性注射器采集大鼠动脉血0.2 mL，采用血气分析仪ABL80(丹麦雷度公司)按照厂商说明进行检测。

各组肺组织10%中性甲醛固定后石蜡包埋切片，苏木素-伊红(北京化学试剂公司)染色后光镜下观察拍照。

5a单克隆抗体(Cell signaling 公司)进行免疫组织化学染色。具体步骤如下：脱蜡、抗原修复后，3% H₂O₂孵育10 min，滴加封闭用正常血清，之间PBS洗3遍，每遍10 min。室温孵育1 h后，滴加适当1∶ 50稀释的一抗，4 ℃过夜。PBS冲洗后，滴加辣根酶标记二抗，室温1 h。PBS冲洗后，DAB显色剂显色，镜下控制反应时间并及时终止反应。显微镜下观察阳性肺泡上皮细胞，并用数码相机拍照，采用Image-Pro Plus 6.0分析系统对切片进行图像分析。每张切片测定5个视野(×200)，取均数作为测定值。空白对照采用抗体稀释液代替一抗。

获得肺组织进行匀浆并采用碧云天公司生产的蛋白裂解液进行裂解，并通过12 000 r/min离心10 min后去上清液进行蛋白定量。蛋白定量采用Pierce公司生产的BCA蛋白定量试剂盒进行。将蛋白溶液与适当体积的载样缓冲液混合后于100 ℃煮沸5 min。蛋白样品采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，随后将蛋白胶通过转膜反应转移到PVDF膜上。采用5%脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h后，与一抗4 ℃孵育过夜，通过TBST洗涤3遍后与带有辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。通过TBST洗涤3遍后采用Pierce公司的化学分光底物在X线片上进行曝光。蛋白水平的相对定量采用美国国立卫生院所提供的Image J软件进行。本文中所用到的抗体p-GSK-3β、GSK-3β及β-catenin购自美国Cell signaling公司。GAPDH被作用内参在免疫印迹中进行使用。

依RNA提取试剂盒说明书，提取肺组织RNA。取RNA样品，按RNA逆转录试剂盒说明书，配制反转录反应液，42 ℃保温2 h，95 ℃保温15 min后冰上冷却，得到cDNA。按实时定量PCR试剂盒说明书在冰上准备50 μL PCR扩增反应体系：2XSYBR 25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，双蒸水20.7 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL。在PCR仪上反应，条件：预孵育95 ℃ 120 s；扩增95 ℃ 20 s、59 ℃ 25 s、72 ℃30 s,45个循环；溶解曲线95 ℃ 20 s。反应结束后，确认real-time PCR的扩增曲线和溶解曲线，得到每个样本的Ct值。GAPDH作为内参照，利用2^-ΔΔCt公式计算Vegf、Axin2、Cyclin D1和Klf4 mRNA表达情况。

采用SPSS 11.5统计软件对文中的数据进行处理。所有的数据采用均数±标准差(x±s)表示。多组间的比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

在骨髓细胞接种后3 d第一次换液，可见少量细胞贴壁成克隆样生长。随着生长时间的延长，细胞逐渐融合成漩涡状，在培养的第14天可见融合度为90%左右的成纤维样细胞(图 1A)。经流式检测确认，所获得的细胞为CD34阴性、CD45阴性、CD29阳性、CD44阳性及CD90阳性(图 1B)。这与国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)提出的标准及文献报道的间充质干细胞的表型相符^{[14, 15]}。

图 1 间充干细胞的形态特征(A)及表型鉴定(B) Fig.1 Mesenchymal stem cells morphology(A)and flow identification(B)

图选项

肺湿干比的结果显示(图 2A)，LPS组的湿干比在6 h[(6.02±0.74)vs.(4.48±0.10),P<0.05]，24 h[(4.91±0.10)vs.(4.50±0.10),P<0.05]和48 h[(4.70±0.10)vs.(4.51±0.10),P<0.05]均显著高于Control组。相比于LPS组，LPS+MSC组的湿干比在6 h[(6.02±0.74)vs.(5.01±0.10),P<0.05]及24 h[(4.91±0.10)vs.(4.75±0.06),P<0.05]时均显著下降，而在48 h两者差异无统计学意义。PaO₂的结果显示(图 2B)：LPS组在6 h[(59.13±3.72)vs.(95.50±4.54),P<0.05]，24 h[(70.00±1.77)vs.(94.62±4.57),P<0.05]和48 h[(71.75±2.12)vs.(94.50±4.14),P<0.05]均显著低于Control组。相比于LPS组，LPS+MSC组在6 h[(59.13±3.72)vs.(69.93± 2.62),P<0.05]，24 h[(70.00±1.77)vs.(74.50±1.85),P<0.05]和48 h时[(71.75±2.12)vs.(79.75±2.12),P<0.05]均显著低升高。肺组织切片结果显示(图 2C)：经过MSCs治疗后，肺组织水肿有所减轻，只有少量中性粒细胞浸润。

与Control比较,aP<0.05;与LPS组比较,bP<0.05 图 2 各组肺湿干比、动脉氧分压比较及肺组织HE染色结果(×200) Fig.2 The lung wet to dry ratio,arterial oxygen partial pressure and lung tissue HE staining comparison(×200)

图选项

通过免疫组化实验，笔者发现Wnt 5a的水平在发生ALI后会有显著的上升，而在经过MSCs移植的肺组织中有显著的下降(图 3A)。笔者并没有观察到其他Wnt配体在肺组织中的表达(数据未显示)。此外，通过免疫印迹实验，还发现MSCs能够显著下调p-GSK-3β和β-catenin的水平，从而发挥对ALI的治疗的作用(图 3B)。

与Control比较，aP<0.05; 与LPS组比较，bP<0.05;A:Wnt5a在肺组织中的表达；B:Wnt信号通路胞内分子的免疫印迹分析 图 3 各组24 h时间点肺组织Wnt信号通路参与成分分析 Fig.3 Composition analysis of lung tissue Wnt signaling pathway at 24hamong each group

图选项

通过实时定量PCR，对Wnt信号通路的靶基因水平进行检测，结果显示，在发生ALI的大鼠中Vegf、Axin2、Klf4及Cyclin D1均显著上升(图 4)；而在经过MSCs处理的ALI大鼠肺组织中，Vegf、Axin2、及Klf4均有显著下降，而Cyclin D1却有显著的上升(图 4)。

图 4 Wnt信号通路相关靶基因的表达情况 Fig.4 The expression of Wnt signaling pathway target genes

图选项

在本项研究中，采用贴壁分离法成功分离培养骨髓间充质干细胞，然后通过尾静脉注射细菌脂多糖构建大鼠急性肺损伤模型，采取骨髓MSCs对急性肺损伤进行治疗。在此过程中，笔者对Wnt/β-Catenin信号通路的组成成分进行了分析，结果显示，Wnt信号通路配体Wnt 5a参与到了间充质干细胞治疗急性肺损伤的过程中。此外，Wnt信号通路胞内分子GSK-3β的磷酸化和β-catenin的水平也参与到该过程中。此外，在经过MSCs治疗的急性肺损伤大鼠中，Wnt信号通路的靶基因Vegf、Axin2、及Klf4均有显著下降，而Cyclin D1却有显著地上升。本研究初步证实Wnt信号通路的配体，胞内分子及相关靶基因在MSCs治疗内毒素性急性肺损伤的过程中发挥着作用。

LPS诱导的肺损伤是目前常用的模拟人体急性肺损伤的模型。通过给大鼠尾静脉注射细菌脂多糖可以引起急性肺损伤，而且这种肺损伤与人体急性肺损伤的情况的情况比较类似，都有包括肺炎等症状的出现^[16]。细菌可以通过释放纤毛毒素、肺炎球菌溶血素、内毒素和免疫球蛋白A蛋白酶等，中和黏膜的清除作用，活化肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及上皮细胞来实现急性炎症反应^[17]。研究认为，在LPS注射的6~48 h内，肺的生理结构的变化最为显著^[18]。因此本研究采取6、24及48 h三个时间点作为观察肺结构变化及检测肺湿干比、PaO₂的时间点。本研究观察到LPS损伤组中肺湿干比在这3个不同的时间点都显著高于Control组；此外在LPS组中3个时间点的PaO₂ 均显著低于Control组。肺组织病理结构观察发现，LPS损伤组的肺组织在不同时间点均出现肺泡结构的破坏、肺间质的增宽、肺水肿及炎症细胞侵润的现象。这些结果显示已经正确的建立了急性肺损伤的大鼠模型。而在进行MSCs注射后，发现肺水肿及损伤的情况有显著的降低。该结果与他人所报道的结果一致^[19]。

研究显示，Wnt信号通路被认为参与到了人体多种生理过程中。越来越多证据显示，在肺纤维化疾病中，博来霉素引起的病理性肺纤维化过程中及伤口损伤修复的过程中均有Wnt信号的参与^[20]。近来的研究显示在肺损伤发生后，Wnt信号的过度激活可能导致细胞外基质成分的过度释放，从而引起肺纤维化^[21]。此外，Wnt信号的活化能够刺激肺上皮细胞的过度增殖及胶原的合成^[22]。这些研究均证实Wnt信号在肺损伤中有重要的作用。本实验结果显示，MSC治疗能够显著降低Wnt配体Wnt 5a的水平。Villar等^[23]的研究证实在败血症导致的急性肺损伤中，Wnt 5a的水平有显著地增加，而MSCs可以降低Wnt 5a的水平，这可能是通过抑制活化细胞的分泌作用而发挥效应的。此外，Li等^[24]的研究证实抑制Wnt/β-Catenin信号通路能够保护肺泡巨噬细胞避免由脂多糖引起的凋亡。Sun等^[25]的研究发现抑制Wnt/β-Catenin信号通路能够促进MSCs向肺损伤归巢从而更好的达到修复的作用。本研究检测到胞内的Wnt信号通路分子GSK-3β的磷酸化和β-catenin的表达水平在MSCs处理后均有显著的下降。

Vegf、Axin2、Cyclin D1和Klf4作为wnt信号通路的靶基因。在Wnt信号传导通路中，Axin作为一种构架(scaffold)蛋白参与APC/Axin/GSK-3β/β-catenin复合体的形成，促进Wnt通路的关键因子β-catenin磷酸化，并最终通过泛素蛋白酶体途径降解，使wnt通路处于低活性状态^[26]。细胞周期素D1(Cyclin D1)是一种原癌基因，可以与CDK4结合，磷酸化Rb，进而启动S期相关基因的转录，使细胞由G1期进入S期。研究表明，抑制 Cyclin D1 基因表达后，能够明显抑制血管内皮生长因子的表达^[27] 。VEGF刺激血管内皮细胞的增殖、迁移，对血管生成(angiogenesis)起主要作用，研究证实VEGF是肺血管发育过程中不可或缺的调节因子,参与了BPD (Broncho-Pulrnonary Dysplasia)病理发生,对肺发育起着重要作用^[28]。Krtippel样因子4(KLF4)，也称为胃肠富集Krtippel样因子(gut-enrich Krtippel like factor，GKLF)，最近有研究发现klf4与肺损伤相关^[29]。

在Villar等^[30]的另一项研究中显示，在发生肺纤维化的情况下，Wnt信号通路的分子包括Vegf、Axin2、Cyclin D1和Klf4发生活化。同时，笔者对Wnt信号通路的靶分子进行了检测，结果与他们的结果一致。另外在进行MSCs处理的大鼠中，本研究发现，Vegf、Axin2、及Klf4均有显著下降，而Cyclin D1却有显著的上升。说明Wnt信号通路受到抑制。

综上所述，本研究初步阐明MSCs对急性肺损伤的治疗作用是通过影响Wnt5a的水平，降低GSK-3β和β-catenin的磷酸化及提高Wnt信号靶基因的表达得以发挥的，Wnt信号通路参与到MSCs治疗急性肺损伤的过程中。调控Wnt信号通路的活化可能可以作为治疗急性肺损伤治疗的新靶点。