脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应，是各种严重烧伤、缺氧、再灌注损伤及外科手术后的常见并发症，目前已成为重症监护室患者的首位死亡原因^{[1, 2]}。研究发现，脓毒症患者体内一氧化氮(nitric oxide,NO)合成过多，血管收缩性降低，引发心肌缺血、冠状动脉损伤、休克和器官衰竭等症状^[3]。其中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)是参与NO合成的重要物质^[4]。因此寻找抑制iNOS表达以减少NO合成对于改善血管收缩功能和防治脓毒症发生发展具有重要意义。辛伐他汀是临床上常用的一种调脂药，通过下调血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平降低心血管疾病的发病风险^[5]。研究发现辛伐他汀还具有抑制炎症因子释放、抑制炎症细胞粘附、调节凝血剂纤溶系统、调节免疫和维护血管内皮功能等作用^[6]。Esposito等^[7]研究发现辛伐他汀可调控过氧化物酶体增生物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-α)和核因子κB(nuclear factor Kappa B,NF-κB)信号通路抗炎和保护血管内皮功能的作用。因此，本研究通过动物实验观察辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠血管收缩能力的影响，试图探讨辛伐他汀在脓毒症防治中的作用及机制。

清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量为200~250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒和引物购自美国invitrogen公司；NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；NF-κB、PPAR-α和iNOS抗体购自美国Santa Cruz公司；凝胶电泳迁移率检测试剂盒购自美国Promega公司。

40只雄性Wistar大鼠随机(随机数字法)分成4组：对照组、假手术组，脓毒症组和辛伐他汀组。对照组未经任何处理；假手术组省略盲肠远端结扎及盲肠穿刺，其余操作同脓毒症组；脓毒症组经盲肠远端结扎和盲肠穿刺制备脓毒症模型，具体方法参照盲肠结扎穿刺大鼠脓毒症模型改良^[8]；辛伐他汀组在制备脓毒症模型前用20 mg/(kg·d)剂量的辛伐他汀灌胃预处理4周。模型制备成功后6 h处死大鼠进行实验。

颈椎脱臼法处死Wistar大鼠，固定后从腹部向胸腔剪开，暴露胸腔，剥离主动脉，用止血钳夹紧主动脉两端后剪取中间部分，迅速置于Krebs-heneleit(K-H)液中，K-H液需事先缓慢充入由95%O₂和5%CO₂组成的混合气体。10倍K-H母液配方 (mmol/L)为：NaCl 118，KCl 4.7，MgSO₄·7H₂O 1.2，NaHCO₃ 20，KH₂PO₄ 1.1，葡萄糖4.5，CaCl₂ 1.25。使用时调整K-H液的pH至8.1~8.4之间。将血管在K-H液中不停漂洗，尽量去除血管内残余血液。小心去除血管壁外周的结缔组织和脂肪组织后，剪取约3 mm长的动脉环放入4 ℃预冷的K-H液中，通入混合气体，用于检测血管收缩性。

血管槽中以0 g张力孵育各组主动脉血管，45 min后将3 mm长的血管环连接至张力换能器，调节张力至2 g左右，稳定45 min 待张力维持于同一水平线时，记为初始张力。用60 mol/L的KCl刺激主动脉血管收缩，待记录仪稳定于最大值时，记为终末张力，对比各实验组血管终末张力与初始张力的差值，探讨主动脉血管收缩能力。

各组剪取适量大鼠主动脉血管，置于匀浆器中与磷酸盐缓冲液一起冰浴匀浆，离心取上清液。按试剂盒说明书操作，依据硝酸还原酶法原理检测各组血管内NO水平。

取适量大鼠主动脉组织，经异硫氰酸胍法提取组织总RNA，用逆转录试剂盒扩增获得cDNA，利用PPAR-α、NF-κB和iNOS的引物进行RT-PCR，检测各基因mRNA水平。采用Western Blot方法检测各组PPAR-α、NF-κB和iNOS蛋白表达水平。

取适量大鼠主动脉组织，经改良的电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测NF-κB活性^[9]。提取各组血管核蛋白，考马斯亮蓝法对各组核蛋白进行定量。将含NF-κB特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3’)探针末端标记为[γ-32P]ATP。经DNA与核蛋白结合反应后用聚丙烯酰氨凝胶电泳。放射自显影后扫描分析。

计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，两组间比较采用成组t检验，组间两两比较用方差分析及SNK-q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

对照组大鼠主动脉血管收缩能力较好，假手术组与对照组血管收缩能力比较，差异无统计学意义。较之于对照组，脓毒症大鼠血管收缩能力显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。辛伐他汀组与脓毒症组相比血管收缩能力显著提升，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见图1。提示辛伐他汀预处理可以改善脓毒症大鼠主动脉血管收缩能力。

与对照组比较，aP＜0.01；与脓毒症组比较，bP＜0.01 图 1 各组主动脉血管收缩能力比较

图选项

经试剂盒检测NO水平，从结果中可以看出，假手术组与对照组之间的差异无统计学意义；脓毒症组NO水平显著高于对照组(P＜0.01)；辛伐他汀组NO水平比对照组高(P＜0.01)，但NO水平显著低于脓毒症组(P＜0.01)，见图2。提示脓毒血症能上调NO水平，而辛伐他汀预处理能逆转脓毒症上调的NO水平。

与对照组比较，aP＜0.01；与脓毒症组比较，bP＜0.01 图 2 各组主动脉血管NO含量比较

图选项

从RT-PCR结果中可以看出，假手术组与对照组之间的差异无统计学意义；脓毒症组iNOS、PPAR-α和NF-κB的mRNA水平显著高于对照组(P＜0.01)；辛伐他汀组iNOS、PPAR-α和NF-κB的mRNA水平比对照组高(P＜0.01)，但显著低于脓毒症组(P＜0.01)，见图3。提示，脓毒血症能促进iNOS、PPAR-α和NF-κB的mRNA的表达，而辛伐他汀预处理能逆转脓毒症上调的iNOS、PPAR-α和NF-κB的mRNA水平。

与对照组比较，aP＜0.01；与脓毒症组比较，bP＜0.01 图 3 各组主动脉血管iNOS、PPAR-α和NF-κB的mRNA水平

图选项

与对照组相比，假手术组NF-κB、PPAR-α和iNOS 蛋白表达水平差异无统计学意义；脓毒症组3种蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01)，辛伐他汀组3种蛋白表达相比与脓毒症组显著受到抑制(P＜0.01)，见图4。提示辛伐他汀能抑制PPAR-α和NF-κB蛋白表达，减少iNOS表达。

与对照组比较，aP＜0.01；与脓毒症组比较，bP＜0.01 图 4 各组NF-κB、PPAR-α和iNOS 蛋白表达情况

图选项

与对照组相比，假手术组NF-κB活性差异无统计学意义；脓毒症组NF-κB显著滞后，活性高于对照组(P＜0.01)；辛伐他汀组与脓毒症组相比NF-κB活性显著受到抑制(P＜0.01)，见图5。提示辛伐他汀能抑制NF-κB活性。

与对照组比较，aP＜0.01；与脓毒症组比较，bP＜0.01 图 5 各组NF-κB活性比较

图选项

脓毒症是患者感染之后常见的一种综合征，能显著性诱发机体免疫紊乱，致使多器官功能失调，其致死率较高^{[1, 2]}。其中脓毒症诱发脓毒症休克等心血管疾病与血管内皮破损、血管收缩能力降低和NO水平增高相关^[10]。NO是由精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的作用下合成的一种重要信号分子，在维持血管正常收缩功能中发挥重要作用^[11]。NO的大量生成可以降低血管张力，降低心脏和血管对儿茶酚胺的敏感性，抑制心肌收缩等病理改变。本研究结果显示辛伐他汀预处理可以降低血管NO水平，改善脓毒症大鼠主动脉血管收缩功能。Luiking等^[12]研究发现给脓毒症休克患者注射精氨酸可以上调NO水平，促进脓毒症休克的发展。提示辛伐他汀可以通过降低NO水平和改善血管收缩，在抑制脓毒症及相关心血管疾病的发生发展过程中发挥积极作用。

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是介导急性脓毒症休克的关键因子，当TNF与受体结合时可以激活下游PPAR-α和NF-κB等信号通路，调控多种促炎因子表达，诱发并加速脓毒症的发生发展^[13]。iNOS作为NOS的重要亚型之一，对于NO的生成具有重要意义。研究发现激活PPARα可上调下游靶基因iNOS表达^{[14, 15]}，因此调控PPAR-α和NF-κB，对于抑制iNOS表达，降低NO生成，保护血管内皮功能具有重要意义。本研究结果显示用辛伐他汀处理可能通过抑制PPAR-α和NF-κB的表达，降低NF-κB活性，下调iNOS和NO水平，改善血管收缩。

他汀类药物即羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，是临床上广泛使用的调脂药物，新近研究发现他汀类药物还有有多种其他功能，其中Meta分析证实他汀药物对于脓毒症和感染具有一定的治疗作用^{[16, 17, 18]}。辛伐他汀是一种常见的他汀药物，研究发现其可以通过抑制NF-κB诱导的iNOS表达，降低炎症反应，保护视神经损伤^{[7, 10]}。笔者之前的研究也发现辛伐他汀可能通过上调BCl-2并下调Bax表达，保护内皮细胞，抑制脓毒症大鼠血清诱导的内皮细胞凋亡^{[19, 20]}。本研究的结果显示辛伐他汀预处理能够下调iNOS mRNA和蛋白的表达，保护内皮细胞，改善脓毒症大鼠血管收缩。

综合上述结果，本研究通过离体主动脉环实验和检测相关因子表达水平探讨了辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠血管收缩的作用，并初步论证了辛伐他汀可能通过抑制PPAR-α/NF-κB信号通路，下调iNOS表达，降低NO的生成量，保护内皮细胞，改善脓毒症血管收缩能力。初步探讨了辛伐他汀改善脓毒症血管收缩的作用和机制，为脓毒症及其合并的心血管疾病防治提供了新的药物作用途径和靶点。