百草枯(paraquat，PQ)是全球广泛应用的除草剂，也是自杀和意外中毒的常见毒物。PQ的中毒剂量小，缺乏有效治疗措施，病死率为60%～90%^{[1, 2, 3]}。肾脏是PQ排泄的主要器官，肾脏损伤显著减少PQ清除，增加肺内蓄积，加重肺损伤，从而加速患者死亡^{[4, 5]}。为探讨PQ肾脏损伤的分子机制，本研究建立小鼠模型，选用全转录表达谱芯片进行检测，并对检测结果进行基因信息学分析和分子生物学实验验证。

SPF级雄性C57BL/6小鼠20只，4~6周龄，体质量(18.7±2.0)g，由复旦大学医学院实验动物科学部提供，动物生产许可证号：SCXK(沪)2009-0019，动物使用许可证号：SYXK(沪)2009-0082。

20%百草枯溶液(克无踪，先正达公司，中国)，miRNeasy mini试剂盒(QIAGEN，德国)，DNase I消化酶(QIAGEN，德国)，Ambion^ WT Expression试剂盒(Ambion，美国)，mRNA芯片及相应配套设备(Affymetrix genechip mouse gene 1.0 ST，美国)，40%甲醛(AR级，国药集团化学试剂有限公司)，离心机(Eppendorf 5417c，德国)，Real-time Master Mix试剂(Toyobo公司，日本)，硝酸纤维素膜(孔径为0.22 μm，Whatman公司，英国)，半干电转移仪和化学发光凝胶成像仪(Bio-Rad公司，美国)，封闭用脱脂奶粉，Nlrc5,Serpinb9,Rnf135大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司)，HRP标记山羊抗鼠Ig G(Bethyl公司，美国)，ECL系统(北京中山生物公司)，48孔细胞培养板孔(Costar公司，美国)，DY-B2 型脱色摇床(江苏兴化市分析仪器厂)，FluorChemQ多功能成像和定量分析系统(Cell Bioscience)。

雄性C57BL/6小鼠20只，相同条件以标准饲料、饮用水饲养，恒温恒湿，人工照明12 h/d，24 h自由进水、进食。实验前适应环境1周，无异常变化者纳入实验。随机(随机数字表)分为对照组(A组)和中毒组(B、C、D组)，每组5只。通过小鼠灌胃，分别建立对照及百草枯中毒模型。A组予以0.01 mL/g体质量蒸馏水灌胃，B、C、D组予以百草枯原液20%加蒸馏水稀释至0.05%，按0.01 mL/g体质量灌胃。A组于灌胃后即刻处理，B、C组分别于染毒6 h、24 h处理，D组观察48 h病死率。处理方法：A、B、C组在相应时点予戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，取血后处死，迅速取出右肾组织并三等分，立即置于液氮冻存。

以QIAzol试剂抽提肾脏组织总RNA。将液氮保存的组织置于陶瓷碾钵内低温下彻底碾碎成粉末，加入QIAzol试剂匀浆，离心后上清液以氯仿抽提，以乙醇沉淀，离心后用DEPC水溶解沉淀。

采用Ambion WT Expression试剂盒完成体外逆转录、cRNA扩增及ds-DNA合成。

对筛选出的核心基因进行PCR验证，采用Applied Biosystems Step One Real-time RCR系统在ABI 7900上完成，利用Real-time Master Mix试剂检测目的基因表达，以GAPDH为内参基因，目的基因ΔCt值=目的基因Ct值-内参基因Ct值。引物序列如表 1。

常规方法提取冻存标本总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转膜，用5%脱脂奶液(100 μL Tween +5 g脱脂奶粉/100 mL)封闭1 h。依次经一抗(多克隆抗体：鼠抗Nlrc5、Rnf135、Serpinb9，1∶ 250；β-actin，1∶ 400)、二抗(辣根过氧化物标记的山羊抗鼠抗体(1∶ 5 000)孵育，加ECL显色后用Fluor ChemQ系统分析蛋白表达水平。

计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 19.0进行统计学分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

D组5只小鼠在24～48 h内均死亡，病死率为100%；B组6 h、C组24 h复测体质量均明显下降。

对肾组织总RNA进行紫外定量和甲醛变性凝胶电泳，A260/A280在1.97～2.06之间，28 s、18 s条带清晰、5 s条带不明显(图 1)，表明总RNA具有较高的纯度及完整性。

A：对照组；B：6 h组；C：24 h组 图 1 对照组和中毒组肾脏总RNA电泳图(部分) Fig 1 RNA electrophoretogram (excerpts)

图选项

Affymetrix genechip mouse gene 1.0 ST芯片共有77万探针，已知基因总数为28 853个，经过欧洲生物信息中心数据库确认的基因总数为27 543个。经过多分类的差异基因筛选分析，共发现1 792个已知的差异基因。与对照组相比，PQ中毒6 h组肾脏共有780个差异基因表达上调(其中Klhl5基因最高上调78.13倍)，1 012个差异基因表达下调(其中Sesn1基因最高下调7.64倍)；24h组肾脏共有390个差异基因表达上调(其中Slco3a1基因最高上调678.83倍)，1 402个差异基因表达下调(其中Fpr1基因最高下调164.54倍)。对差异基因进行分层聚类分析并建立表达图谱(图 2系差异基因表达图谱的一部分)。

图 2 差异基因的分层聚类分析表达图谱(部分) Fig 2 Clustering of differential gene expression (excerpts)

图选项

差异基因表达趋势，是具有代表性的表达趋势模型的集合。对差异基因表达的16种趋势进行显著性分析，计算其各自P值，发现5种趋势的差异具有统计学意义(P＜0.05)(图 3)。所有差异基因共有16种表达趋势，每种趋势可以一个方框表示，上方的数字是表达趋势编号，下方的数值是P值，红色方框表示5种有统计学意义的表达趋势(P＜0.05)，其中4号和16号基因表达趋势的差异性最为可靠(其P值分别为5×10^-55和8×10^-47)。252个基因体现出第4号表达趋势(图 4A)，PQ中毒6 h、24 h表达水平进行性降低；458个基因体现出第16号表达趋势(图 4B)，PQ中毒6 h内表达水平逐渐升高，6 h之后，表达水平持续降低。

图 3 差异基因表达趋势显著性分析 Fig 3 The results of STC analysis of differentially expressed genes

图选项

图 4 PQ中毒小鼠肾脏基因表达趋势图(A：4号趋势，涉及252个基因；B：16号趋势，涉及458个基因) Fig 4 Genetic expression trend (A: No.4, related to 250 genes; B: No.16, related to 458 genes)

图选项

根据NCBI的BioSystems数据库中信号通路间相互作用关系，构建PQ中毒后差异基因表达构成的细胞内信号传递网络，对筛选出的差异基因进行核心信号通路分析，构建整个通路之间的信号转导关系。根据差异基因表达情况，计算网络中K-Core、Outdegree、Indegree等反映网络节点性质的参数，得出各基因之间的调控关系和联系程度。基于对照组、PQ中毒6 h组和24 h组差异基因表达的相关性，构建3个状态下的基因共表达网络(图 5)。其中，以K-core值大于5且Degree大于8为标准选择8个关键网络节点作为核心基因。见表 2。

圆圈越大表示重要性越高，连线表示相互联系 图 5 差异基因共表达网络图 Fig 5 Genetic co-expression network

图选项

对筛选出的8个核心基因进行实时定量PCR验证，引物溶解曲线和扩增曲线见图 6。

A=Nlrc5，B=Serpinb9，C=Cd40，D=Rnf135，E=Dhx58，F=Sp110，G=Fcgr1，G=Arhgef12 图 6 核心基因PCR引物的溶解曲线和扩增曲线 Fig 6 The melt curve and amplification plot of primer in real-time PCR

图选项

以对照组为参照，分别计算PQ中毒6 h组、24 h组8个待验证基因的ΔΔCt值(表 2)。与对照组相比，中毒6 h组Nlrc5基因表达上调有统计学意义，中毒24 h组Rnf135基因表达上调有统计学意义；而与PQ中毒6 h组相比，中毒24 h组Rnf135和Serpinb9基因表达上调有统计学意义。这与基因芯片检测结果一致。

对PCR验证差异有统计学意义的3个基因(Nlrc5、Rnf135、Serpinb9)进一步行Western blot验证(图 7)，均与对照组比较。中毒6 h组，Nlrc5、Rnf135、Serpinb9表达上调有统计学意义(P＜0.05)；中毒24 h组，Rnf135、Serpinb9表达上调有统计学意义(P＜0.05)，Nlrc5表达下调有统计学意义(P＜0.01)。结果不仅与基因芯片检查和PCR验证吻合，还发现了中毒24 h Nlrc5表达下调有统计学意义，提示Nlrc5表达先上调(6 h)后下调(24 h)。

与对照组比较，a P＜0.05，b P＜0.01，c P＜0.01 图 7 核心基因Western blot Fig 7 Western blot validation for the key genes

图选项

Tomita等^{[6, 7]}采用大鼠毒理学芯片检测了肺、肾组织1 176个基因的表达(Rat Toxicology 1.2 Array，Clontech)，结果提示有30个基因mRNA水平增高超过1.3倍；Satomi 等^{[8, 9]}进行了肺组织表达谱的研究。基因芯片技术为探寻PQ肾脏病变分子机制提供了合理的思路和方法，但以往的研究仍存在不足：(1)PQ中毒的不同阶段可能出现同一基因不同的剪切产物，此前采用的基因芯片不能精确地检测全长基因的可变剪切状态，不能检测不同PQ浓度或不同时点发生的同一基因不同转录本，因而无法找到靶基因；(2)实验结果大都缺少基因信息学分析，单凭基因表达水平的高低判定是否为主要基因，缺乏调控PQ中毒表型的核心基因策略，尚未涉及到较为全面的细胞内信号转导途径及相互作用。

本研究采用的Affymetrix genechip mouse gene 1.0 ST芯片，能够克服上述缺陷。作为全转录组研究工具，其具有如下优势：(1)常规芯片仅以3’端序列表达量为基因表达量，该芯片实现真正的全长转录水平测定，检测的准确性很高；(2)3’端被剪切的转录本(在体内可占到30%)、3’端出现新外显子的转录本、无poly-A尾的转录本、RNA降解样本的转录本等等，常规芯片均无法检测，该芯片则能够检测；(3)该芯片还可检测出基因转录时的可变剪切。

通过建立重度PQ中毒C57BL/6小鼠模型，应用Affymetrix genechip mouse gene 1.0 ST基因芯片探索中毒6 h、24 h肾脏基因表达水平的变化，共发现1 792个已知的差异基因。通过生物信息学分析，构建基因共表达网络(Gene-Rel-Net)，根据K-core值和Degree，筛选出8个可能在PQ导致肾脏损伤中发挥关键作用的核心基因。应用PCR、Western blot等分子生物学方法验证，结果与生物信息学分析一致。

Nlrc5主要参与固有免疫，负性调节NF-κB信号转导通路和I型干扰素信号转导通路^{[10, 11]}；Rnf135参与固有免疫应答、蛋白泛素化和正性调节β-干扰素^{[12, 13]}；Serpinb9主要参与抗凋亡和细菌防御过程^[12]；CD40则主要参与炎症反应、B细胞激活和增殖、调节细胞膜受体信号转导通路等免疫过程^{[14, 15, 16, 17]}。本研究初步证实PQ中毒后在肾脏中Rnf135、Serpinb9基因于早期(6 h)表达上调，随后(6～24 h)持续在较高水平；Nlrc5基因在早期(6 h)表达上调，后期(24 h)下调明显。

2010年体外研究证实NLRC5能同时抑制NF-κB和I型IFN通路，在炎症免疫应答中扮演重要角色^[10]。Nlrc5蛋白是天然免疫系统中核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)家族的成员，有关Nlrc5分子的研究起步不久。天然免疫系统调控有三条信号通路：NF-κB通路、I型IFN通路和炎症小体通路调控，NF-κB和I型IFN通路是机体炎症反应中两条重要的信号通路^{[13, 18]}，PQ中毒患者NF-κB通路活性明显增高^{[10, 19]}。据此推测，核心基因Nlrc5参与PQ中毒肾脏损伤，其可能机制为Nlrc5在后期表达下调，NF-κB和I型IFN通路随之激活，从而引发“瀑布”样连锁炎症反应。

基因芯片技术是探寻PQ肾脏病变分子机制的恰当途径，本研究所采用的全转录表达谱芯片能够准确把握基因表达产物的全景，经分子生物学实验验证，结果一致性高，最终证实Nlrc5、Rnf135、Serpinb9是急性百草枯中毒小鼠肾脏损伤的核心基因，其参与肾脏损伤的具体机制有待进一步研究^[20]。