2015, Vol. 24
急性百草枯(paraquat，PQ)中毒是常见急诊危重症，由于目前无特效解毒药，百草枯口服中毒病死率高达70％以上[1, 2]。肾脏是百草枯损害的主要靶器官之一，中毒病例中急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)发病率高达50%[3, 4]，如何防治百草枯中毒急性肾损伤是研究热点与难点之一。笔者前期研究已证实，药物甘草酸二铵(diammonium glycyrrhizinate，DG)可明显减轻中毒大鼠急性肺损伤程度，其作用机制可能与调控Toll样受体4(toll-like receptor,TLR4)/核因子kappaB(nuclear transcription fator-kappa B,NF-κB)信号通路，抑制炎症因子的产生有关[5]，DG是否对百草枯中毒致急性肾损伤具有保护作用，目前尚无相关报道。本研究拟建立百草枯诱导大鼠急性肾损伤模型，观察DG预治疗对肾组织TLR4、Myd88和NF-κB的调控作用，以探究DG对百草枯肾损伤大鼠的作用机制。
1 材料与方法 1.1 药品及主要试剂20％百草枯水剂(先正达南通作物保护有限公司,中国)，甘草酸二铵(江苏正大天晴制药有限公司，中国)，Trizol总RNA抽取试剂盒(Invitrogen公司，美国)，逆转录试剂盒(Fermentas公司，美国)，GoTaqqPCR Master Mix(Promega公司，美国)，DNA电泳marker(东盛生物公司，中国)，大鼠IL-6 、IL-10ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，中国)，NF-κB p65、Myd88、TLR-4免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。
1.2 实验动物及分组健康SD大鼠50只，雌雄不分，体质量(200~250)g，由广西医科大学动物中心提供，动物合格证号：SCXK(桂)2009-0002。根据随机数字表法将大鼠分为PQ染毒组(PQ组，n=20)、DG干预组(DG组，n=20)和空白对照组(NS组，n=10)。
1.3 动物建模PQ组及DG组予以百草枯100 mg/kg一次性灌胃，NS组予以等量生理盐水灌胃。DG组在PQ灌胃后立即腹腔注射50 mg/kg甘草酸二铵，PQ组及NS组给予腹腔注射等量生理盐水，每24 h重复注射一次。去除死亡大鼠，其余动物均于染毒后72 h处死并留取标本。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。
1.4 检测指标与方法染毒72 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹主动脉血检测Cr、BUN，离心取上层血清用于ELISA检测，取右肾组织-80 ℃保存。4%多聚甲醛溶液固定左肾48 h，脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化染色。
1.4.1 肾组织形态学观察取左肾组织切片，经脱蜡、HE 染色、梯度乙醇脱水、透明、封固后光镜下观察。按刘芙蓉等[6]报道的方法，评定肾组织损伤分级,其分级标准: 0级,肾组织结构清晰，未见明显水肿、充血、变性等病理学改变；Ⅰ级,肾小球上皮细胞轻度肿胀，肾小管管腔未见明显狭窄，肾小球结构正常；Ⅱ级,肾小管上皮细胞肿大，管腔变窄，但未见管腔完全闭锁，肾小球结构正常; Ⅲ级,肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性、坏死，管腔狭窄，部分管腔闭锁，间质充血、水肿，部分可见细胞核固缩，细胞结构消失，肾小球结构紊乱。
1.4.2 免疫组化染色观察将切片干燥、脱蜡、水化、蒸馏水冲洗，参考Konno等[7]文献中方法评分。每张切片在400倍镜下随机选择5个视野，综合染色强度及阳性细胞数量进行半定量分析。根据免疫阳性细胞染色程度(A)：无染色为0分；细胞膜或质内见淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；较多棕黄色颗粒为2分；大量棕黄色颗粒为3分。每片随机观察5个视野，计数500个细胞中染色阳性细胞数(B)：阳性细胞数<5%为0分,5%~25%为1分，25%~50%为2分，50%~75%为3分，>75%为4分。A与B相乘为其最后得分。每张切片求平均值统计，分析TLR4、Myd88和NF-κB的表达与DG的关系。
1.4.3 血清和肾组织中IL-6、IL-10质量浓度检测大鼠腹主动脉血离心取上层血清，将大鼠右肾组织匀浆，大鼠 IL-6、IL-10 ELISA试剂盒检测各组大鼠血清及肾组织IL-6、IL-10质量浓度，操作步骤按说明书进行。
1.4.4 实时荧光定量PCR(qPCR)测定取右肾组织，用Tizol法提取右肾组织总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，采用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒以已合成 cDNA 为模板进行 real-time PCR 反应。TLR4、Myd88、NF-κB的引物序列见表 1。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火/延伸30 s，扩增30个循环。PCR完成后，用MxPro-Mx3005P软件分析基因的扩增情况，得到相应Ct值，以β-actin作为内参照，每组设3个复孔，基因相对表达量(RQ)采用2-ΔΔCt方法计算。
| 目标物 | 上游引物 | 下游引物 |
| β-actin | 5’- TGTGCCCATCTATGAGGGTTAC -3’ | 5’- ATGTCACGCACGATTTCCCT -3’ |
| TLR4 | 5’- GGCATCATCTTCATTGTCCTTG -3’ | 5’- AGCATTGTCCTCCCACTCG -3’ |
| Myd88 | 5’- GTCGCATGGTGGTGGTTGTT -3’ | 5’- ATAGGGATCAGTCGCTTCTGTTG -3’ |
| NF-κB | 5’- GATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC -3’ | 5’-GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTGCT-3’ |
应用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组相互比较采用SNK-q检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肾功能评估百草枯中毒72 h后，PQ组大鼠血清BUN和Cr水平均明显高于NS组(均P<0.01)；DG干预后，血清BUN和Cr水平较PQ组明显下降(均P<0.01)。结果见表 2。
| (μmol/L，x±s) | |||
| 组别 | n | Cr | BUN |
| NS组 | 10 | 41.08±3.51 | 5.25±0.47 |
| PQ组 | 17 | 77.07±4.60a | 10.49±0.98a |
| DG组 | 18 | 54.02±4.03b | 7.56±0.57b |
| F值 | 266.014 | 168.160 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | |
| 注：与NS组比较，aP<0.01；与PQ组比较，bP<0.01 | |||
PQ组可见肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性、坏死；管腔狭窄，部分管腔闭锁；部分可见细胞核固缩，细胞结构消失，肾小球结构紊乱，肾组织分级Ⅲ级。DG组的肾小管上皮细胞肿大，管腔变窄，但未见管腔完全闭锁，肾小球结构正常，肾组织损伤分级Ⅱ级。NS组肾组织结构清晰，未见明显水肿、充血、变性等病理学改变。肾组织损伤分级0 级。见图 1。
 |
| 图 1 大鼠肾组织结构变化(HE×200) Fig 1 The changes of rat kidney tissue structure (HE×200) |
TLR4主要表达在肾细胞胞膜上；Myd88主要表达在细胞胞质；NF-κB P65主要表达在细胞胞质，同时也有少量表达在细胞核。NS组、DG组、PQ组TLR4指标统计得分分别为(2.0±0.7)分、(6.1±1.4)分、(9.2±1.6)分，差异有统计学意义(F=79.139，P<0.01)；NS组、DG组、PQ组Myd88指标统计得分分别为(1.3±0.7)分、(3.5±1.2)分、(7.5±1.7)分，差异有统计学意义(F=61.799，P<0.01); NS组、DG组、PQ组NF-κB P65指标统计得分分别为(2.4±0.8)分、(6.6±1.4)分、(10.5±1.4)分，差异有统计学意义(F=112.740，P<0.01)。结果提示DG能同时抑制百草枯中毒肾组织TLR4、Myd88、NF-κB P65蛋白的表达。见图 2。
 |
| A、B、C为TLR4表达；D、E、F为Myd88表达；G、H、I为NF-κB P65表达 图 2 TLR4、 Myd88、NF-κB P65表达免疫组化染色(SP×400) Fig 2 The expression of TLR4,Myd88 and NF-κB P65 in kidney by immunohistochemical staining(SP×400) |
PQ组、DG组肾组织及血清中IL-6、IL-10的质量浓度较NS组均有不同程度升高，差异有统计学意义(P<0.01)；DG组升高程度显著低于PQ组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表 3。
| (pg/mL,x±s) | ||||||
| 组别 | n | IL-6 | IL-10 | |||
| 肾组织 | 血清 | |||||
| NS组 | 10 | 44.27±4.06 | 120.84±12.38 | 35.26±6.34 | 55.18±6.74 | |
| PQ组 | 17 | 93.50±7.43 a | 173.24±14.33 a | 64.92±8.96 a | 85.65±8.76 a | |
| DG组 | 18 | 65.66±6.59 b | 151.23±8.54 b | 86.67±12.97 b | 106.17±11.79 b | |
| F值 | 192.997 | 63.279 | 79.473 | 87.511 | ||
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | ||
| 注：与NS组比较，aP<0.01；与PQ组比较，bP<0.01 | ||||||
NS组大鼠肾组织中TLR-4、Myd88和NF-κB mRNA均有少量表达；PQ组、DG组TLR-4、Myd88和NF-κB mRNA表达明显增强，与NS组比较差异有计学意义(P<0.01)；DG组表达明显弱于PQ组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表 4。
| (x±s) | ||||
| 组别 | n | TLR-4 mRNA | Myd88 mRNA | NF-κB mRNA |
| NS组 | 10 | 1.00±0.05 | 1.00±0.06 | 1.00±0.04 |
| PQ组 | 17 | 3.40±0.55a | 3.25±0.69a | 4.07±0.81a |
| DG组 | 18 | 2.49±0.70b | 2.34±0.68b | 2.65±0.76b |
| F值 | 84.408 | 60.683 | 86.272 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
| 注：与NS组比较，aP<0.01；与PQ组比较，bP<0.01 | ||||
肾是人体最大的主要排泄器官，百草枯摄入后12～24 h，超过90％以原型通过肾脏分泌排泄[8]，肾损伤的程度与百草枯中毒病死率和预后密切相关。高浓度的百草枯影响肾脏细胞的氧化还原反应进程，通过氧自由基破坏细胞的防御机制，引起近端肾小管坏死，导致急性肾功能衰竭[9]。百草枯致毒机制尚未完全明确，目前研究较为成熟的机制是超氧化物的形成引起的氧化应激反应以及NF-κB等信号途径介导的一系列的炎症反应[10]。
本实验结果显示，百草枯染毒大鼠肾组织中TLR4、Myd88、NF-κB mRNA/蛋白表达量明显高于正常组大鼠，提示TLR4受体介导的TLR4/Myd88/ NF-κB信号通路可能参与了百草枯中毒大鼠急性肾损伤的炎症反应。TLR4是识别细胞外抗原信息并向细胞内传递，从而引发炎性反应的一种关键跨膜蛋白[11]，其可以通过Myd88依赖途径激活[12]，引起IRAK自磷酸化，最终激活NF-κB[13]，从而引起IL-6、IL-8、TNF-α等一系列炎症因子的合成与释放，导致机体组织器官损伤[14]。本实验中，PQ组大鼠血清和肾组织中IL-6、IL-10质量浓度较NS组均有不同程度的升高，提示IL-6、IL-10参与了PQ致肾损伤这一过程，其中血清中IL-6表达水平与肾损伤炎症反应程度成正相关，在炎症发展过程中至关重要，可以作为评估肾损伤严重程度的参考指标[15]。IL-10主要由单核巨噬细胞产生，是强有力的抗炎因子，可以抑制炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的产生，早期炎症中适当的释放可以减轻肾损伤[16, 17]。而IL-10等内源性抗炎因子相对减少，不足以对抗促炎因子的产生或拮抗其活性，将导致促炎-抗炎因素的失衡，在早期肾损伤的发生、发展中起了重要作用，但是它们都属于下游细胞因子。近年来，研究发现TLR4/Myd88通路异常与急性肾损伤的发病机制密切相关[18, 19, 20]，Lin等[21]发现敲除TLR4受体基因的糖尿病大鼠较正常大鼠蛋白尿、肾脏损害明显减轻以及NF-κB的表达减少，证实了TLR4信号途径主导糖尿病肾病的炎症反应。有研究表明，缺血-再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞中TLR4表达增加，随之NF-κB激活，炎症反应到达高峰，短期即可出现急性肾功能衰竭[19]。Brown等[22]研究发现，给予TLR4受体激动剂，可加强内毒素感染的小鼠肾脏炎症反应，反之，敲除TLR4基因后，肾脏炎症反应减轻。进一步证实，TLR4作为炎症反应损伤的扳机点启动肾损伤的病理过程。因此，调控TLR4/Myd88/ NF-κB信号通路，抑制炎症反应，将成为治疗百草枯肾损伤一新的切入点。
本实验采用甘草酸二铵干预百草枯染毒大鼠，结果显示大鼠肾脏损伤程度减轻，肾组织中TLR4、Myd88、NF-κB基因和蛋白表达量明显降低，提示该药物对百草枯中毒肾损伤具有一定保护作用，但其作用机制尚未明确。在SD大鼠缺血-再灌注急性肺损伤研究发现，甘草酸二铵可以上调糖皮质激素受体[23]，一方面促进热休克蛋白及IL-10表达，另一方面抑制大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB、TNF-α及IL-18过度表达[24, 25]，从而达到抗炎作用。Jin等[26]研究发现，甘草酸二铵可通过激活Nrf2信号途径和抑制炎症介质NF-κB的表达，明显改善丙戊酸(VPA)诱导的小鼠氧化应激性肝损伤及炎症反应。此外，甘草酸二铵可抑制TGF-131/Smads通路的激活，减少肾间质纤维连接蛋白的沉积，减轻输尿管梗阻所致大鼠肾间质的纤维化[27]。本试验结果发现，肾组织中TLR4、Myd88、NF-κB基因和蛋白表达变化与肾功能、病理变化趋势一致，推测甘草酸二铵肾损伤保护机制与调控TLR4/Myd88/NF-κB信号通路有关，下一步将针对肾小管上皮细胞TLR4、NF-κB进行受体阻断实验研究，以明确甘草酸二铵具体作用机制。
| [1] | Hwang KY,Lee EY,Hong SY. Paraquat intoxication in Korea[J]. Arch Environ Health,2002, 57(2):162-166. |
| [2] | Dawson A,Buckley N. Integrating approaches to paraquat poisoning[J]. Ceylon Med J,2007, 52(2):45-47. |
| [3] | Ricci Z,Ronco C. Today’ s approach to the critically ill patient with acute kidney injury[J]. Blood Purif,2009,27(1):127-134. |
| [4] | Kellum JA. Acute kidney injury[J]. Crit Care Med,2008,36(4 Suppl):S141-145. |
| [5] | 李浩,张剑锋,张伟,等. 甘草酸二铵对百草枯中毒致急性肺损伤大鼠TLR-4表达的影响[J]. 蛇志,2014,26(1):1-3,15. |
| [6] | 刘芙蓉,佟飞,田英平,等. 不同染毒剂量百草枯中毒大鼠肾损伤病理表现[J]. 河北医科大学学报,2008,29(4):504-506. |
| [7] | Konno R,Yamakawa H, Utsunomiya H,et al. Expression of survivin and Bcl-2 in the normal human endometrium[J]. Mol Hum Reprod,2000,6(6):529-534. |
| [8] | 许佳俊,郑建涛,朱景法. 肿瘤坏死因子-α 诱导蛋白6治疗减轻百草枯中毒大鼠急性肾损伤 [J].中华危重病急救医学,2014,26(6):405-408. |
| [9] | 刘尊齐,纪宏斌,王海石,等. 急性肾损伤网络分期在急性百草枯中毒中的预后价值[J]. 中华危重病急救医学,2014,26(4):223-227. |
| [10] | 陈娇,钱晓明,任艺,等. p38MAPK在百草枯中毒致大鼠急性肺损伤中的作用研究[J]. 中国急救医学,2014,34(2):183-186. |
| [11] | Takeda K,Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors[J]. Annu Rev Immunol,2003,21:335-376. |
| [12] | Tanaka T,Legat A,Adam E,et al. DiC14-amidine cationic liposomes stimulate myeloid dendritic cells through Toll-like receptor 4[J]. Eur J Immunol,2008,38(5):1351-1357. |
| [13] | Zhang X,Shephard F,Kim HB, et al. TILRR, a novel IL-1RI co-receptor, potentiates MyD88 recruitment to control Ras-dependent amplification of NF-kappaB[J]. J Biol Chem,2010,285(10):7222-7232. |
| [14] | Ren W,Wang Z,Hua F,et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates LPS-induced TLR4/MD-2 pathway activation and inflammation in alveolar macrophages[J]. Inflammation,2015,38(1):384-393. |
| [15] | Grigoryev DN,Liu M,Hassoun HT,et al.The local and systemic inflammatory transcriptome after acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(3):547-558. |
| [16] | 孙健波,顾鹏毅,李刚,等. 孟鲁司特对百草枯所致大鼠肺损伤的治疗作用[J].中华急诊医学杂志,2012,21(11):1198-1204. |
| [17] | 苏群,方强,阮战伟.地塞米松对脓毒症大鼠急性肾功能衰竭细胞因子的影响[J]. 中华急诊医学杂志,2007,16(3):263-266. |
| [18] | Rocchi R,Kimura H,Tzou SC,et al. Toll-like receptor-MyD88 and Fc receptor pathways of mast cells mediate the thyroid dysfunctions observed during nonthyroidal illness[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(14):6019-6024. |
| [19] | Wu H,Chen G,Wyburn KR,et al. TLR4 activation mediates kidney ischemia/reperfusion injury[J]. J Clin Invest,2007,117(10):2847-2859. |
| [20] | Liu B,Yang Y,Dai J,et al. TLR4 up-regulation at protein or gene level is pathogenic for lupus-like autoimmune disease[J]. J Immunol,2006,177(10):6880-6888. |
| [21] | Lin M,Yiu WH,Wu HJ,et al. Toll-like receptor 4 promotes tubular inflammation in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol,2012,23(1):86-102. |
| [22] | Brown HJ,Lock HR,Wolfs TG,et al. Toll-like receptor 4 ligation on intrinsic renal cells contributes to the induction of antibody-mediated glomerulonephritis via CXCL1 and CXCL2[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(6):1732-1739. |
| [23] | 张剑锋,李超乾,郑晓文,等. 甘草酸二铵上调急性肺损伤大鼠糖皮质激素受体的表达[J]. 重庆医学,2012,41(10):970-972. |
| [24] | 张剑锋,李超乾,磨静佳,等.甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织转化生长因子β1及高迁移率族蛋白1表达的影响[J].中国急救医学,2010,30(5):435-438. |
| [25] | 张剑锋,李超乾,磨静佳,等.甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织糖皮质激素受体及核因子κB表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志,2010,19(3):245-249. |
| [26] | Jin J,Xiong T,Hou X,et al. Role of Nrf2 activation and NF-kappaB inhibition in valproic acid induced hepatotoxicity and in diammonium glycyrrhizinate induced protection in mice[J]. Food Chem Toxicol,2014,73:95-104. |
| [27] | 马立彬,邓刚,王鸣,等. 甘草酸二铵抗大鼠肾间质纤维化作用及其机制[J]. 华中科技大学学报:医学版,2007,36(6):756-759. |