内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)是一种多潜能干细胞，参与损伤血管的修复和重建，已广泛应用于缺血性疾病、心血管疾病和肿瘤的防治研究^{[1, 2, 3]}。近年来研究发现EPC通过动员、迁移、归巢和分化等参与损伤肺组织的修复，并能减少炎症细胞的浸润、缓解肺损伤^{[4, 5]}。基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9,MMP-9)主要由中性粒细胞、巨噬细胞所分泌，在炎症状态下MMP-9大量分泌造成肺损伤^{[6, 7]}。本研究主要观察EPC移植后对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)组织中MMP-9的影响，从而进一步探讨EPC移植对损伤肺组织修复的作用。

同遗传背景的清洁级SD大鼠50只，体质量100～150 g，用于EPC的采集；清洁级成年SD大鼠36只，体质量250～300 g，随机(随机数字法)分为3组(n=12)：PBS组、LPS组、EPC组。动物均由解放军第三军医大学实验动物中心提供，实验中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要试剂：淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)、RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)、兔抗大鼠MMP-9的一抗及相应的二抗(santa cruz公司)。

EPC的分离、培养及鉴定的具体方法参见文献[4, 8, 9]。

大鼠经1%戊巴比妥5 mg/kg腹腔麻醉后经尾静脉注入脂多糖(5 mg/kg)诱发ALI；ALI造模0.5 h后，取培养第10天的EPC，胰酶消化后用无菌PBS稀释悬液(2×10⁶/0.5 mL)经大鼠尾静脉注入；EPC移植7 d后取大鼠肺组织置于-70 ℃保存备用。PBS组：等量的PBS/1 mL+ EPC悬液(2×10⁶/0.5 mL)；LPS组：等量的LPS/1 mL +等量的PBS/0.5 mL；EPC组：等量的LPS/1 mL +EPC悬液(2×10⁶/0.5 mL)。

取大鼠右肺下叶，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片5 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察肺组织形态变化；根据Bustos等^[10]方法从四项指标进行肺损伤评分：(1)肺泡充血；(2)出血；(3)间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；(4)肺泡间隔增厚或透明膜形成；根据每项指标病变轻重进行0～4分半定量分析，累加各项评分的总分作为ALI的病理评分。

采用RT-PCR方法，取冻存的肺组织，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA后进行PCR扩增。具体步骤按说明书操作。引物序列由大连宝生物公司设计并合成。如表 1所示。

取冻存的肺组织，加裂解液提取总蛋白，加变性缓冲液煮沸10 min变性。SDS-PAGE凝胶电泳，200 mA湿转 2 h。于5%BSA中封闭1 h，加入兔抗大鼠MMP-9的一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBS漂洗，加入HRP-山羊抗兔IgG(1∶ 1 000)室温下孵育1.5 h，TBS漂洗，ECL光化学法显色。结果经吸光度面积积分分析，与内参照β-actin产物条带的比值作为相对含量。

采用SPSS 16.0 统计学软件处理，计量数据以均数±标准差(x±s)表示，组间两两比较采用SNK-q法，以P <0.05为差异具有统计学意义。

石蜡切片HE染色后可见PBS组肺泡腔结构完整；LPS组肺泡结构破坏、间隔增厚、间质增生，同时伴有大量炎性细胞浸润，与PBS组比较，肺损伤评分显著增加，差异有统计学意义(12.25±1.14 vs.1.83±0.58,t=-0.275，P <0.01)；与LPS组比较，EPC组中大部分肺泡结构完整，肺间质增生减轻，炎症细胞浸润显著减少，肺损伤评分较LPS组显著降低(7.17±0.94 vs.12.25±1.14,t=19.56,P <0.05)，见图 1~2。

A：PBS组；B：LPS组；C：EPC组 图 1 肺组织HE染色(×200)

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LPS组与PBS组比较，aP <0.05; EPC组与LPS组比较，bP <0.05 图 2 各组肺组织的肺损伤评分

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与PBS组比较，LPS组中MMP-9表达显著增加(1.49±0.14 vs. 0.44±0.03;t=-0.232,P <0.05)；EPC组中MMP-9 mRNA的表达较LPS组显著减少，组间差异有统计学意义(0.69±0.25 vs.1.49±0.14; t=20.49，P <0.05)，见图 3。

LPS组与PBS组比较，aP <0.05; EPC组与LPS组比较，bP <0.05 图 3 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达

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LPS组中MMP-9蛋白的表达较PBS组显著增加(1.28±0.04 vs.0.24±0.03，t=-0.726，P <0.05)，但EPC移植后显著降低了MMP-9蛋白的表达，组间差异有统计学意义(0.65±0.03 vs.1.28±0.04，t=40.85，P <0.05)，见图 4。

LPS组与PBS组比较，aP <0.05; EPC组与LPS组比较，bP <0.05 图 4 Western-blot检测MMP-9蛋白的表达

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ALI是由感染、创伤、中毒、失血等病因使肺内炎症细胞聚集而介导的肺内失控性炎症反应。中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞被激活后可释放多种炎症介质、中性丝氨酸和各种蛋白酶，释出的蛋白酶可引起弹性蛋白、蛋白多糖和胶原降解而导致细胞、血管基膜的损伤和组织结构的破坏。基质金属蛋白酶(MMPs)是一种能降解细胞外基质蛋白的内肽酶，MMP-9 是该家族中的一种，主要由中性粒细胞、巨噬细胞所分泌，是降解细胞基膜主要组分Ⅳ型胶原的重要酶类，它的分泌与激活可导致呼吸道上皮和血管内皮通透性增加、结构破坏，研究发现肺实质中的MMP-9 过表达时，则会引起严重的肺损伤。

EPC是来源于骨髓的原始干细胞，在缺氧、缺血、炎症、外伤等因素刺激下，能参与损伤血管的修复及微血管新生，EPC移植被认为是血管性疾病最有前景的治疗措施之一^{[11, 12]}。近年来人们开始将EPC研究引入到炎症领域，在ALI/ARDS中也见报道，目前研究发现EPC移植后能显著减少炎症细胞浸润、降低肺泡-毛细血管膜的通透性，缓解肺组织损伤^{[4, 5, 13]}。Kim等^[14]和Jiang等^[15]研究发现，间充质干细胞移植后显著降低了损伤组织中基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-9的表达，缓解了组织损伤。因此，在本研究当中，选择了MMP-9作为观察指标，进一步探讨EPC移植促进血管修复、缓解肺损伤的可能机制。

本研究发现，给予LPS刺激后加重了肺损伤，HE染色可见LPS组的肺泡结构破坏，部分肺泡腔变小，内见较多的炎性细胞，肺损伤评分较PBS组显著增加(P <0.05)；EPC组的大部分肺泡结构完整，肺泡结构破坏和炎性细胞浸润减轻，肺损伤评分较LPS组显著降低(P <0.05)。本实验同时联合RT-PCR和Western-blot方法检测了各组肺组织中MMP-9的含量，LPS组中MMP-9的表达量较PBS组显著增加(P <0.05)，而EPC组中的MMP-9 mRNA和蛋白的表达量与LPS组比均降低，差异有统计学意义(P <0.05)，提示LPS刺激导致肺内炎症细胞的浸润，促进了MMP-9等蛋白酶和炎症介质的大量释放，加重了肺损伤；但EPC移植后减少了炎性细胞浸润，抑制了炎症细胞释放各种蛋白酶和炎症介质，减少了蛋白酶对肺组织基膜胶原的降解，从而缓解了肺部损伤。

既往研究认为EPC通过直接整合到血管内皮单层和旁分泌的方式参与修复血管，维持肺泡-毛细血管膜结构稳定。本实验提示EPC移植后除直接整合修复血管外，还通过减少炎症细胞浸润、抑制基质金属蛋白酶MMP-9的释放，降低肺组织基膜胶原的降解，从而缓解肺损伤，此可能是EPC缓解肺损伤的另一重要机制。