脓毒症(sepsis) 是严重创伤休克及感染常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克，且临床治疗收效甚微，有报道我国重症监护室严重脓毒症高发病率和病死率 ^[1]。脓毒症可导致严重的多器官功能障碍^[2]。在脓毒症复杂的发病机制中，凝血系统紊乱是病死率增加的一个重要原因^{[3, 4, 5]}。脓毒症是诱发炎症反应和凝血活化的重要刺激因素，凝血活化和炎症反应之间存在明显的交叉反应。血小板活化是凝血系统激活过程中的重要事件，在脓毒症的发生发展和转归中具有重要作用^[6]，有研究表明造血系细胞特异性蛋白-1(hemato-poieticlineage cell-specific protein-1，HS1)在血小板活化中意义重大，但其调节因子却不甚明确^[7]。而血小板在脓毒症中的一些自身参数特征以及功能和参与HS1调节的重要蛋白需要进一步深究。因此本研究对150例脓毒症患者血小板活化相关的重要膜糖蛋白及其下游关键信号分子HS1变化展开相关的前瞻性研究。

本课题获得我院医学伦理委员会的同意和批准，以及患者或家属的同意并签订知情同意书后开始实验研究。选择2012年5月至2013年10月期间我院急诊科收治脓毒症患者150例，脓毒症诊断标准(依据国际脓毒血症会议2012年标准)^[7]，即明确感染灶或怀疑有感染，至少满足下列2项临床标准：①T>38.3 ℃或<36 ℃； ②P>90次/min；③R>20次/min；或PCO₂ <32 mmHg (1 mmHg＝0.133 kPa)；④WBC >12×10⁹/L或<4×10⁹/L或不成熟杆状细胞10%。排除标准：①年龄18岁；②慢性疾病终末期；③急性胰腺炎但明确无感染者；④肿瘤患者入院后28 d内死亡患者；⑤既往无血液系统疾病。 共有221例患者纳入初期研究，最终150例患者符合研究条件。其中男76例，女74例，年龄(58.5±11.5)岁，主要感染部位：肺部102例，腹腔28例，胆道8例，皮肤软组织4例，尿路8例。同时以50例健康体检人员作为对照组，其男25例，女性25例，年龄(62.5±13.5)岁，既往无血液系统疾病史。两组性别、年龄构成差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

诊断为脓毒症后取EDTA抗凝全血，使用日本SYSMEX血球计数仪检测血小板特征参数。

在微孔中包被纤维蛋白原4 ℃过夜，加入富血小板血浆(PRP)(血小板约2×10⁸/mL)，37 ℃孵育90 min，PBS洗涤微孔，多聚甲醛固定10 min后再使用0.1% Triton x-100室温下破细胞膜3 min，PBS洗涤细胞3次后使用质量浓度为50 μg/mL FITC-phalloidin (溶于DMSO)(Alexis,USA)，室温下染色30 min，PBS清洗3次后，吸去多余水分，封片后荧光显微镜下40倍观察，并计数^[9]。

使用血小板凝集仪对PPP进行检测^[10]。

洗涤血小板，使用ATP检测试剂盒(Sigma,USA)对其胞内的ATP进行检测^[7]。

洗涤血小板，使用RIPA(含蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂) (Cat:POO13C,碧云天，中国)裂解血小板，加入2×loading buffer，行8% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜 (Bio-Rad,USA)，使用anti-HS1单克隆抗体和anti-phosph-HS1抗体(Abcam,USA)进行杂交。

获得健康人洗涤血小板，加入LPS (Sigma,USA)作为刺激，另外加入LPS组的血小板分别以及同时加入Syk特异性抑制剂piceatannol(Selleck,USA)和Src特异性抑制剂PP2(Selleck,USA)，行Western blot鉴定p-HS1。

本研究所有数据通过SPSS 13.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组计量资料间比较采用成组t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

脓毒症组患者血小板计数显著低于健康人对照组；而脓毒症组血小板分布宽度和平均血小板体积均较健康人组显著升高，两组间三个参数比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表 1。

脓毒症组血小板较健康人组有更强的黏附性，见图 1A和1B；脓毒症组血小板较健康人组有较高的聚集性，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图 1C；对血小板内ATP的检测结果显示，脓毒症患者血小板ATP显著低于健康人组，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示脓毒症组血小板释放能力强于健康人组。见图 1D。

A：健康人组血小板黏附功能；B：脓毒症组血小板黏附功能；C：脓毒症组血小板凝集功能高于健康人组(P<0.01)；D：脓毒症组血小板内ATP低于健康人组(P<0.01) 图 1 两组间血小板功能的比较 Fig 1 comparison of platelte function between healthy donors and sepsis

图选项

通过WB对脓毒症组和健康人对照组的HS1及p-HS1的检测，结果显示，脓毒症组HS1高于健康人组，且差异具有统计学意义(P<0.01)见图 2A；进而对HS1磷酸化的检测中发现，脓毒症组p-HS1比例远高于健康人组，且差异具有统计学意义(P<0.01)，见图 2B。提示脓毒症血小板中HS1总量以及HS1磷酸化程度均增高。

A：脓毒症组与健康人组血小板HS1的表达；B：脓毒症组与健康人组血小板p-HS1的表达 图 2 脓毒症组血小板HS1及p-HS1的表达高于健康人组 Fig 2 Sepsis patients have higher HS1 and p-HS1 than healthy donors

图选项

通过分离健康人血小板，使用LPS刺激血小板建立体外脓毒症模型，加入Syk特异性抑制剂piceatannol以及Src特异性抑制剂PP2从而探究其对HS1磷酸化的影响，结果显示Src和Syk均对HS1的磷酸化有意义，即Src及Syk的活性下降能够下调HS1磷酸化程度，且差异具有统计学意义(P<0.01)，见图 3。

图 3 Syk、Src对血小板HS1磷酸化的影响 Fig 3 Impact of HS1 phosphorylate by Syk and Src

图选项

脓毒症是炎症反应和凝血活化的重要刺激因素，凝血活化和炎症反应之间存在明显的交叉反应。脓毒症导致凝血系统紊乱，血小板异常活化与血小板相关膜糖蛋白以及下游信号分子传导关系紧密。其中HS1在血小板活化过程中发挥关键作用^[7]。因此对血小板膜糖蛋白及其调节因子的功能的研究，能够为阻断脓毒症从而提供新的治疗方案。

本研究发现脓毒症患者血小板数量显著低于健康人，其血小板分布宽度以及平均血小板体积与健康人差异显著，提示血小板数目以及功能的改变与脓毒症相关，可能与大多数细菌能够导致血小板TOLL样受体4结合启动免疫反应^[11]，导致血小板损伤甚至破裂^[12]。继而在对血小板功能的研究中发现，脓毒症组血小板其黏附、聚集、释放功能均较健康人组增强，而该功能的增强进一步加剧了血小板的消耗，甚至最终导致弥散性血管内凝血(DIC)的发生。

在对脓毒症血小板HS1和p-HS1的检测中发现，脓毒症组血小板HS1高于健康人组，这与HS1是血小板活化的一个重要标志相吻合，近年亦报道LPS能够诱导血小板HS1升高^[13]。众所周知，HS1主要存在静息血小板的胞质中，当血小板活化时p-HS1升高，研究结果显示HS1在Syk、Src激酶的作用下磷酸化，且Syk先于Src并且共同作用于HS1并使之磷酸化方能使之信号传导。而最新研究表明活化的HS1从胞质内转移至细胞膜，HS1能够导致血小板黏附、聚集、释放功能增强，从而加剧脓毒症的转归。

综上所述，本研究通过对脓毒症患者血小板参数及功能以及血小板HS1蛋白磷酸化的研究，展示了脓毒症中血小板的活化的重要标志HS1蛋白以及其调节因子，这有可能为脓毒症的凝血功能障碍治疗提供新的思路。