中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (11): 1302-1305
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文 0
于璐, 徐峰. RIP3-依赖性细胞坏死在脓毒症中研究进展[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(11): 1302-1305.
RIP3-依赖性细胞坏死在脓毒症中研究进展
于璐, 徐峰     
215006 江苏省苏州，苏州大学附属第一医院急诊科
收稿日期: 2015-06-11
徐峰，Email：sz_xf@suda.edu.cn

脓毒症(sepsis)是一种严重感染引起的全身炎症反应[1, 2]，它可以被看作是从感染到多器官功能障碍综合征的持续恶化[3]。在美国，脓毒症是重症监护病房中非心脏病死亡的首要原因，每年发病超过80万人，病死率高达30％[4]，花费占美国总住院费的39％[5]，但仍缺乏有效的治疗手段。脓毒症的致病机制尚不清楚，促炎和抗炎细胞因子失衡在脓毒症的发生和发展中起着重要作用。近年来研究发现，蛋白激酶3(receptor interaction protein kinase 3,RIP3)-依赖性细胞坏死是这一过程的重要参与者。本文综述了RIP3参与的细胞坏死信号途径以及 RIP3-依赖性细胞坏死在脓毒症中作用机制的研究进展。

1 RIP3-依赖性细胞坏死

目前认为，在发育过程中有机体存在三种常见死亡方式，即细胞凋亡(apoptosis)、细胞自嗜(autophagy)和细胞坏死(necrosis)。其中依赖于caspase的细胞凋亡被认为是最主要的可以调控的细胞死亡方式。不同于细胞凋亡，细胞坏死最开始被认为是一种非调控的细胞死亡方式，然而随着对细胞死亡不断的深入研究，越来越多的研究表明，坏死在某些情况下同样可以受到不同调控因子的调控。人们已经认识到，在TNF-α诱导的坏死性细胞死亡的过程可以被调控，即程序性细胞坏死[6]。近年来发现受体相互作用RIP3参与程序性坏死的调控，其激酶活性在调控过程中必不可少[7, 8, 9]。RIP3是丝氨酸/苏氨酸家族的成员，它的N-末端激酶结构域是类似于其他RIP家庭成员包括蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)，RIP2和RIP4，而蛋白激酶的C-末端具有独特的结构域[10]。RIP3通过与RIP1形成坏死信号复合物(necrosome)触发程序性坏死，并且被证明是用作TNF-α诱导的细胞凋亡和坏死的分子开关[7, 8, 9]。

2 RIP3-依赖性细胞坏死途径

细胞坏死是其通过自溶活体导致细胞过早死亡的组织细胞损伤形式。细胞坏死能够引发一系列的炎症反应。病原识别受体与死亡受体为主要参与细胞坏死通路的受体。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)，NOD 样受体和RIG-I受体为主要病原识别受体。肿瘤坏死因子受体家族[11, 12, 13]，TRAILRs[14]和CD95[12]为主要死亡受体。下面介绍研究广泛的由TNF-α以及TLRs所介导RIPK3-依赖性细胞坏死途径。

2.1 TNF-α介导的细胞坏死信号途径

TNF-α是一个多功能的细胞因子，激活炎症反应，诱导细胞发生多种死亡方式。当TNF-α激活由肿瘤坏死因子受体(TNF-R)介导的信号通路后，主要包括NF-κB存活途径，依赖于caspase家族蛋白与受体相互作用RIP1的细胞凋亡途径以及RIP3-依赖性细胞坏死途径。在凋亡启动后，caspase-8会在与RIP1结合后切割RIP1从而使坏死复合物无法形成，然而当凋亡启动蛋白caspase-8被抑制时，凋亡无法形成，同时RIP1也无法被切割，RIP1与RIP3相互作用形成坏死复合物，进而启动了程序性的坏死过程[8, 9]。在由TNF-α与caspase抑制剂诱导坏死后，RIP1与受体相互作用RIP3通过它们所共有的RHIM结构域相互结合，相互磷酸化，也进而磷酸化它们下游的混合系列蛋白激酶样结构域蛋白(mix lineage kinase domain-like,MLKL)的第357 位的苏氨酸以及第358 位的丝氨酸。MLKL被磷酸化后发生迁移，当它转移到细胞膜上时，诱导ROS产生，然后通过一系列的下游机制使细胞膜破碎导致了细胞的坏死[15]。Duprez等[16]研究结果表明，不管有没有caspase抑制剂的存在，RIP3依赖的细胞坏死途径可能参与了TNF-α诱导的全身反应综合征。其次，RIP3基因的缺失可以选择性的抑制肝脏相关的细胞坏死，但不影响所造成的肠上皮细胞凋亡。同时，RIP3基因缺失通过减少细胞死亡，组织损伤，以及伴随的持续炎症来保护小鼠对抗TNF-α诱导的全身反应综合征。再次，在致命性的全身炎症反应综合征中，细胞凋亡引起的肠道损伤对病死率影响较小，相反，RIP1与RIP3形成坏死复合物触发的细胞坏死对病死率的影响是至关重要的。尤其值得说明的是，在TNF-α诱导的死亡中，RIP3依赖的细胞坏死不是瞬时的炎性基因诱导途径，而是一个关键过程。

2.2 Toll样受体介导的细胞坏死途径

由Toll样受体所介导的信号通路在脓毒症中的研究颇为广泛。TLRs是一类模式识别受体(pattern recognize receptors,PRRs)可以识别不同病原体的病原相关分子模式(pathgen-associated molecule paterns,PAMPs)，在机体对病原体的天然免疫应答中起着非常重要的作用，也是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。细胞水平的坏死在体外实验中可以被一些免疫细胞表面所表达的Toll样受体(TLR)在与细菌脂多糖(lps)或病毒基因组模拟物poly(I:C)结合后所介导。每个Toll样受体识别特异的病原体，例如，TLR2主要识别革兰阳性细菌膜结构，TLR3特异地识别病毒dsRNA以及人工合成的dsRNA-poly(I:C)，而TLR4能识别G-菌胞外膜的主要成分LPS。当TLRs识别相应的病原体后，机体会启动相应的免疫防御应答，如激活NF-κB信号途径和干扰素IFN-β前体。当NF-κB的信号途径被抑制时，LPS会诱导小鼠原代培养的巨噬细胞发生凋亡，而在caspase-8抑制剂的共同作用下能诱导细胞坏死途径[17]。He等[18]研究发现在凋亡受到抑制的情况下，TLR3和TLR4的活化可以诱导巨噬细胞的坏死，此细胞坏死途径并不依赖于TNF信号途径。与野生型巨噬细胞相比，来源于RIP3-/-小鼠的原代巨噬细胞表现出对TLR3/TLR4诱导的细胞坏死的完全抗性，表明RIP3对于TLR3/TLR4诱导的巨噬细胞坏死是必需的。进一步的研究发现，在TLR3或者TLR4被激活时，RIP3通过自身的RHIM结构域与TRIF相互作用形成蛋白复合体，促进ROS的聚集，最终导致巨噬细胞的坏死。动物实验表明，RIP3或者TRIF蛋白功能的缺失能显著地抑制TLR4介导的巨噬细胞的坏死和炎症因子的产生。由于在引发脓毒症中的突出作用，Toll样受体介导的炎症信号通路为学界广泛研究，在此，其介导的坏死信号通路作为一个潜在的治疗靶标，有待进一步探讨。

3 脓毒症中细胞坏死作用机制

在脓毒症中存在大量的细胞凋亡和坏死[19, 20, 21]，凋亡细胞倾向于下调免疫，抑制炎症反应，而坏死细胞倾向于促炎反应、排斥反应以及自身免疫等[22, 23, 24, 25]，它们在脓毒症的发病过程中发挥了重要作用。在TNF-α诱导的全身反应综合征中，RIP3介导的程序性坏死可以发起一个“细胞死亡风暴”，通过损伤相关分子模式分子(DAMPs)的释放挑起强烈的炎症反应[16]。炎症反应是由病原体相关分子模式(PAMPs)和宿主细胞表面表达的模式识别受体(PPRs)之间的相互作用启动。过度炎症的后果是导致组织损伤和细胞坏死，细胞坏死发生时细胞器发生肿胀，染色质浓缩，膜破裂，从而导致损伤相关分子模式的释放，如线粒体因子，高迁移率族蛋白1(HMGB1)，热休克蛋白，尿酸，磷酸腺苷，以及细胞外基质蛋白,从而触发模式识别受体介导无菌炎症[26, 27]。损伤相关分子模式分子(DAMPs)，也被称为危险相关分子模式分子，它们可以在非感染性炎症反应中启动和延续免疫应答。由于非常高水平DAMPS的释放导致免疫细胞的过度刺激，促炎环境引起的强大次级介质(如脂质因子和活性氧)的释放进一步放大炎性过程。监管机制的故障可能会导致炎症丧失控制，最终导致宿主因炎症反应过度激活受损。在脓毒症中，DAMPs的释放与细胞坏死密切相关。随着病情的进展，机体为抑制过度激活的免疫反应，上调抑制性因子的分泌，同时在炎症反应过程中大量的免疫细胞凋亡，例如淋巴细胞和树突状细胞的细胞凋亡水平增加，引起在细胞数显著减少，进一步加重了后期免疫反应的抑制，即代偿性抗炎反应综合征(CARS)，严重影响患者的预后[28, 29, 30]。宋振举等[31]研究表明，不同病情程度的脓毒症患者促炎和抗炎细胞因子的表达存在着明显差异,且免疫状态不同，脓毒症时主要表现为炎症反应的持续激活,重症脓毒症时抗炎症因子表达明显增加。Mayerle[32]研究发现早期的炎症反应越强烈，后期代偿性免疫抑制的程度也就越深。因此，靶向细胞坏死，减轻机体炎症反应，减少破坏免疫稳态可能改善脓毒症后期免疫过度低下及预后。

4 基于脓毒症RIP3-依赖性细胞坏死的干预措施

在脓毒症早期炎症和免疫反应涉及介质繁多，因此，对这种复杂的炎症级联反应的早期干预是对脓毒症治疗是至关重要的。Sharma等[33]研究发现，在严重脓毒症小鼠中，RIP3的缺乏显著延长了生存时间，改善肺结构的完整性并且减弱肝损伤，减少局部炎症反应。此外，在特异器官中，RIP3的缺失可引起嗜中性粒细胞，自然杀伤(NK)细胞和CD8+T淋巴细胞的浸润的减少。因此，RIP3在改变免疫细胞起到了至关重要的作用，可针对RIP3研究新的治疗策略以减弱脏器损伤引起的过度免疫细胞浸润，从而适当延长生存。Duprez等[16]研究表明，RIP3基因缺失显著保护了盲肠结扎穿孔小鼠模型所致的脓毒症，并且减少DAMP的释放，进一步揭示RIP3在脓毒症引起的死亡中发挥至关重要的作用，这表明靶向细胞坏死可能是一个新的有前途的治疗方法。程序性细胞坏死被证明在脓毒症，肿瘤发生，动脉粥样硬化，眼疾病和实体器官移植中发挥重要作用。由于病情进展快从而导致治疗窗窄，目前还不清楚将有可能在何种程度上使用坏死抑制剂进行治疗干预。尽管这样，抑制RIP1激酶活性已成功在缺血-再灌注损伤(IRI)，心肌梗死，脑外伤，急性胰腺炎，炎性肠疾病，眼科疾病，以及肿瘤坏死因子给药后引发全身性炎症反应综合征的实验疾病模型中发挥作用。

5 小结与展望

随着细胞坏死在脓毒症发生与发展过程中研究的逐渐深入，利用干预细胞坏死的手段来防治脓毒症日益受到重视。尽管新的靶向坏死手段不断涌现，然而许多棘手的问题也随之暴露。类似于细胞凋亡，目前研究人员已经证实,坏死性细胞死亡的发生不仅存在于病理过程,还存在于生理过程,如组织更新,胚胎发生和免疫反应[34]。有资料显示，对RIP家族进行广泛的抑制，虽然可以有效减轻坏死的发生，但也阻碍了它们其他功能的发挥；其次，小鼠和人类的免疫系统有着明显的差别，许多在动物模型上行之有效的治疗方法当应用于临床时却遭受失败，因此能够精确模拟人类免疫系统的脓毒症小鼠模型有待建立。目前对脓毒症机体免疫功能平衡状况与动态变化的了解尚缺乏客观准确的指标和评估体系，RIP3-依赖性细胞坏死信号通路的改变能否改善脓毒症的病情转归，RIP3依赖性细胞坏死在脓毒症中分子调控机制，恰当的坏死抑制剂的探寻及如何将研究成果最大程度有效转到临床应用等诸多问题均有待进一步深入研究。

参考文献
[1] Levy MM, Fink MP, Marshall JC, et al. 2001 sccm/esicm/accp/ats/sis international sepsis definitions conference[J]. Intensive Care Med,2003, 29(4): 530-538.
[2] Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine[J]. Chest, 1992, 101(6): 1644-1655.
[3] Annane D, Bellissant E, Cavaillon JM. Septic shock[J]. Lancet, 2005, 365(9453): 63-78.
[4] Dellinger RP, Levy MM, Carlet JM, et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008[J]. Intensive Care Med, 2008, 34(1): 17-60.
[5] Gaieski DF, Edwards JM, Kallan MJ, et al. Benchmarking the incidence and mortality of severe sepsis in the United States[J]. Crit Care Me, 2013, 41(5): 1167-1174.
[6] Galluzzi L, Kroemer G. Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis[J]. Cell, 2008, 135(7): 1161-1163.
[7] Zhang DW, Shao J, Lin J, et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis[J]. Science, 2009, 325(5938): 332-336.
[8] Cho YS, Challa S, Moquin D, et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation[J]. Cell, 2009, 137(6): 1112-1123.
[9] He S, Wang L, Miao L, et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α[J]. Cell, 2009, 137(6): 1100-1111.
[10] Stanger BZ, Leder P, Lee TH, et al. RIP: a novel protein containing a death domain that interacts with Fas/APO-1 (CD95) in yeast and causes cell death[J]. Cell, 1995, 81(4): 513-523.
[11] Laster SM, Wood JG, Gooding LR. Tumor necrosis factor can induce both apoptic and necrotic forms of cell lysis[J]. J Immunol, 1988, 141(8): 2629-2634.
[12] Vercammen D, Brouckaert G, Denecker G, et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways[J]. J Exp Med, 1998, 188(5): 919-930.
[13] Chan FKM, Shisler J, Bixby JG, et al. A role for tumor necrosis factor receptor-2 and receptor-interacting protein in programmed necrosis and antiviral responses[J]. J Biol Chem, 2003, 278(51): 51613-51621.
[14] Holler N, Zaru R, Micheau O, et al. Fas triggers an alternative, caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule[J]. Nature I mmunology, 2000, 1(6): 489-495.
[15] Sun L, Wang H, Wang Z, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase[J]. Cell, 2012, 148(1): 213-227.
[16] Duprez L, Takahashi N, Van Hauwermeiren F, et al. RIP kinase-dependent necrosis drives lethal systemic inflammatory response syndrome[J]. Immunity, 2011, 35(6): 908-918.
[17] Ma Y, Temkin V, Liu H, et al. NF-kappaB protects macrophages from lipopolysaccharide-induced cell death: the role of caspase 8 and receptor-interacting protein.[J]. J Biol Chem, 2005, 280(51): 41827-41834.
[18] He S, Liang Y, Shao F, et al. Toll-like receptors activate programmed necrosis in macrophages through a receptor-interacting kinase-3-mediated pathway[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(50): 20054-20059.
[19] Bantel H, Schulze-Osthoff K. Cell death in sepsis: a matter of how, when, and where[J]. Crit Car, 2009, 13(4): 173.
[20] Messaris E, Memos N, Chatzigianni E, et al. Time-dependent mitochondrial-mediated programmed neuronal cell death prolongs survival in sepsis[J]. Crit Care Me, 2004, 32(8): 1764-1770.
[21] da Silva FP, Nizet V. Cell death during sepsis: integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection[J]. Apoptosis, 2009, 14(4): 509-521.
[22] Sun E. Cell death recognition model for the immune system[J]. Medical Hypotheses, 2008, 70(3): 585-596.
[23] Sun E. The" Miracle" fetus: an excellent model for apoptotic cell-induced immune tolerance?[J]. Front Biosci (Elite Ed), 2008, 1: 466-475.
[24] Sun E, Gao Y, Chen J, et al. Allograft tolerance induced by donor apoptotic lymphocytes requires phagocytosis in the recipient[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(12): 1258-1264.
[25] Sun E, Zhang L, Zeng Y, et al. Apoptotic cells actively inhibit the expression of CD69 on Con A activated T lymphocytes[J]. Scand J Immunol, 2000, 51(3): 232-237.
[26] Chen GY, Nuez G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage[J]. Nat Rev Immunol, 2010, 10(12): 826-837.
[27] Krysko DV, Agostinis P, Krysko O, et al. Emerging role of damage-associated molecular patterns derived from mitochondria in inflammation[J]. Trends Immunol, 2011, 32(4): 157-164.
[28] Bone RC. Sir isaac newton, sepsis, SIRS, and CARS[J]. Crit Care Me, 1996, 24(7): 1125-1128.
[29] Cavaillon J, Adib-Conquy M, Fitting C, et al. Cytokine cascade in sepsis[J]. Scand J Infect Dis, 2003, 35(9): 535-544.
[30] Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, et al. The sepsis seesaw: tilting toward immunosuppression[J]. Nature Med, 2009, 15(5): 496-497.
[31] 宋振举, 郦珊珊, 童朝阳, 等. 脓毒症患者血清促炎和抗炎细胞因子的变化[J]. 中华急诊医学杂志, 2008, 17(11): 1191-1194.
[32] Mayerle J. A novel role for leucocytes in determining the severity of acute pancreatitis[J]. Gut, 2009, 58(11): 1440-1441.
[33] Sharma A, Matsuo S, Yang WL, et al. Receptor-interacting protein kinase 3 deficiency inhibits immune cell infiltration and attenuates organ injury in sepsis[J]. Crit Care, 2014, 18(4): R142.
[34] Raffray M, Gerald MC. Apoptosis and necrosis in toxicology: a continuum or distinct modes of cell death?[J]. Pharmacol Ther, 1997, 75(3): 153-177.