2016, Vol. 25
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury / acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)为儿科临床常见的呼吸系统危重症[1] ，也是严重脓毒症的主要并发症。其主要病理生理机制为感染和创伤导致肺泡间隔高通透性渗出性损伤。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelium type Ⅱ cell,AEC-Ⅱ)是肺泡上皮祖细胞，在肺损伤后可以自身增殖并转分化为肺泡I型上皮细胞(alveolar epithelium typeIcell,AEC-Ⅰ)，可能与多种促肺泡细胞分化发育相关的细胞因子协同启动肺泡组织结构的自我修复过程[2]。研究发现转化生长因子-β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)能促进AEC-Ⅱ转分化为AEC-Ⅰ，因此可以促进肺损伤的修复[3, 4]。目前对基因转染后的细胞进行移植的细胞-基因疗法正逐渐成为研究热点，已开展的研究多针对如A549、NCLH441和MLE15等肿瘤来源的传代细胞株，这些细胞株在功能代谢和形态结构上均不能完全模拟具备原生细胞生物学特征的原代培养AEC-Ⅱ，如缺少细胞间紧密连接，缺少板层小体，不能合成全部或某一类肺表面活性物质成份等[5]，且不能作为细胞移植治疗用。本研究选择原代培养新生猪AEC-Ⅱ为转染对象，构建了TGF-β1重组质粒并转染入原代培养的AEC-Ⅱ中，从而为构建其他对ALI结局有影响的质粒及转染AEC-Ⅱ并实现将转染后细胞移植入动物肺内提供方法学基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂及质粒弹力蛋白酶(上海林叶生物科技有限公司)；猪IgG(北京鼎国生物技术有限公司)；DNaseⅠ、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、琼脂糖、氯化钠、0.25%胰蛋白酶(上海钰森生物技术有限公司)；DH5α菌种(上海睿安生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000和Trizol(德国Invitrogen 公司)；低糖DMEM培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；特级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；XhoⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、T4 DNA Ligase(加拿大Fermentas公司)；质粒DNA小量抽提试剂盒(美国Axygen公司)；DNA凝胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒(日本Takara 公司)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒和AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；人TGF-β1真核表达质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；pEGFP-N1质粒(美国Clontech公司)。
1.1.2 实验动物日龄1~7 d足月雄性新生猪3只，体质量1 000~1 500 g，由复旦大学附属中山医院动物房提供，动物均为普通级，生产许可证号SCXK(沪)2012-0013。动物实验方案经复旦大学附属儿科医院科学和伦理委员会批准同意，动物麻醉及实验处理遵照实验动物使用条例。
1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成及TGF-β1 CDS的扩增从公司购买带有人TGF-β1 CDS(GenBank登陆号：BC022242)的质粒，首先对保存在甘油中的含人TGF-β1全长CDS的质粒(壮观霉素抗性，质粒全长5 200 bp)菌液进行复苏培养，培养16 h后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒和测量浓度，之后进行1%琼脂糖凝胶电泳，将电泳证实条带正确的质粒送公司测序，测序结果证实该质粒含有人TGF-β1 CDS序列。采用Primer Premier 5软件设计带有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点和保护性碱基的引物，引物序列如下(下划线处为酶切位点)：TGF-β1上游(5’ -CCG CTCGAGTGACTGATAGTGACCTGTTCG-3’ )，下游(5’ -CCGGAATTCAGCTGGA TGGCAAATAATGAT-3’ )；内参β-actin上游(5’ -CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT -3’ )，下游(5’ -AATCTCAT CTTGTTTTCTGCG-3’ )。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR扩增TGF-β1cDNA(1 368 bp)，反应体系和条件均按日本Takara公司DNA扩增试剂盒说明书进行。将扩增后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示条带正确后割胶回收，使用PCR产物纯化试剂盒进一步纯化胶回收产物，以提高DNA浓度，去除酶蛋白等，利于随后双酶切反应进行。
1.2.2 pEGFP-N1-TGF-β1质粒的构建采用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切扩增后含TGFβ1 CDS的cDNA及pEGFP-N1质粒，双酶切反应体系如下：TGF-β1 30 μL(16 ng/μL)或pEGFP-N1质粒 5 μL(200 ng/μL)，EcoRI 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，10×Tango Buffer 5 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL；37 ℃反应4 h。T4 DNA Ligase连接双酶切产物，反应体系为：TGF-β1双酶切产物 100 ng(30 μL)，pEGFP-N1双酶切产物20 ng(10 μL)，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 U(0.2 μL)，灭菌蒸馏水加至50 μL；16 ℃反应3 h。制备大肠杆菌感受态DH5α，将连接产物转入大肠杆菌感受态中，涂板培养16 h后，挑选白色透明单菌落接种于含30 μg/mL卡那霉素的LB培养液中37 ℃、220 r/min振摇培养16 h后，使用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳初步证实条带正确后(重组质粒大小为6 085 bp)进行PCR鉴定和送公司测序鉴定。
1.2.3 pEGFP-N1-TGF-β1质粒的鉴定PCR鉴定：取经1%琼脂糖凝胶电泳初步证实条带正确后的重组质粒进行PCR扩增鉴定，PCR引物、体系及条件均与上述从人TGF-β1质粒中扩增TGF-β1cDNA相同，PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否能够扩增出目的基因；测序鉴定：取上述经1%琼脂糖凝胶电泳初步证实条带正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序，然后将测序结果与GenBank中发表的人TGF-β1 cDNA序列对比。经鉴定证实TGF-β1 CDS序列完全正确后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导方法转染原代培养的新生猪AEC-Ⅱ。
1.2.4 新生猪AEC-Ⅱ原代培养方法AEC-Ⅱ原代培养方法为按照本实验室建立方法[6]进行，细胞分离方法相同，采用IgG免疫吸附法纯化分离后细胞，具体方法为：向每个90 mm细菌培养皿中加入浓度为0.05%猪IgG的Tris碱溶液5 mL，室温静置3 h。3 h后弃 IgG，PBS洗2次，DMEM铺皿静置10 min。向每个细菌培养皿中加入浓度为2×106/mL的细胞悬液10 mL，37 ℃，5% CO2培养箱贴壁1 h。1 h后收集培养皿中未黏附细胞，之后将细胞按2×105/cm2密度接种于6孔细胞培养板中培养。细胞在24 h内均采用含5%胎牛血清的低糖DMEM培养，6孔板每孔加液量减少为1 mL。24 h后均换为含10%FBS的DMEM培养，每天换液，换液量为6孔板每孔加1 mL。
1.2.5 脂质体介导的pEGFP-N1-TGF-β1质粒转染原代培养AEC-Ⅱ将原代培养的新生猪AEC-Ⅱ以(1~2)×105/cm2密度接种于6孔细胞培养板上，培养48 h至细胞融合80%~90%，转染前2 h将培养液换为无血清培养液；准备溶液1∶ (250－X)μL无血清培养液＋X μL Lipofectamine 2000/孔，室温孵育5 min；准备溶液2∶ 229 μL无血清培养液＋21 μL pEGFP-N1-TGF-β1质粒每孔(195.5 μg/mL)及230 μL无血清培养液＋20 μL pEGFP-N1质粒每孔(204.0 μg/mL)。转染时分组如下：(1)空白对照组 未加Lipofectamine 2000及质粒；(2)pEGFP-N1质粒转染组 pEGFP-N1质粒20 μL，Lipofectamine 2000 10 μL；(3)pEGFP-N1-TGF-β1质粒转染组(将Lipofectamine 2000与pEGFP-N1-TGF-β1质粒设置不同比例，以找出相对毒性小而转染效率高的最适比例)： pEGFP-N1-TGF-β1质粒21 μL，Lipofectamine 2000的剂量分别为6、 9、12、15 μL。将溶液1与溶液2混合，室温下放置20 min；同时将6孔板中的细胞用无血清培养液冲洗两遍后，加入2 mL 无血清培养液；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37 ℃，5％CO2培养箱中培养6 h；6 h后，更换含有血清的完全培养液，37 ℃，5％CO2培养箱中培养24~48 h后在倒置荧光显微镜下观察转染水平。
2 结果 2.1 人TGF-β1质粒及PCR扩增TGF-β1 cDNA电泳结果质粒和PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，图 1A为5 200 bp的人TGF-β1质粒，图 1B可见大小为1 375 bp的PCR扩增后含全长CDS的TGF-β1 cDNA。
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| A:1泳道为大小5 200 bp人TGF-β1质粒；B:1、2、3泳道均为大小1 375 bp的PCR扩增后含全长CDS的TGF-β1 cDNA；M泳道为DNA marker 图 1 人TGF-β1质粒及PCR扩增TGF-β1 cDNA电泳结果 Fig 1 Electrophoresis results of human TGF-β1 plasmid and PCR amplified cDNA of TGF-β1 |
将TGF-β1 cDNA和 pEGFP-N1质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳结果，见图 2。
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| 1泳道：TGF-β1 cDNA双酶切产物，大小为1 368 bp；2泳道：pEGFP-N1质粒双酶切产物，大小为4 717 bp；3、4泳道：分别为pEGFP-N1质粒XhoⅠ和EcoRⅠ分别单酶切产物，大小均为4 733 bp；M泳道：DNA marker 图 2 TGF-β1 cDNA和 pEGFP-N1质粒的双酶切产物电泳结果 Fig 2 Electrophoresis results of TGF-β1 cDNA and pEGFP-N1 plasmid after double enzyme digestion |
将TGF-β1 cDNA和 pEGFP-N1质粒的双酶切产物用T4 DNA ligase连接后转化入DH5α中，摇菌培养扩增和质粒小量抽提后对抽提的重组质粒行1%琼脂糖凝胶电泳，图 3A可见大小在6 000 bp附近的重组质粒电泳条带，与pEGFP-N1-TGF-β1 重组质粒 6 085 bp相符合。图 3B为采用与扩增人TGF-β1 cDNA相同引物，体系和条件对重组质粒进行PCR反应扩增出的TGF-β1 cDNA经1%琼脂糖凝胶电泳结果，可见在1 300及1 400 bp之间的电泳条带，与的TGF-β1 cDNA片段 1 375 bp相符合。将经PCR鉴定正确的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果与其CDS序列一致(图 4)。
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| A:1、2、3、4泳道均为大小6 085 bp的pEGFP-N1-TGF-β1 重组质粒；B:1、2、3、4泳道均为大小1 375 bp的TGF-β1 cDNA片段；M泳道为DNA marker 图 3 重组质粒电泳及PCR法鉴定结果 Fig 3 Identification results of electrophoresis and PCR of recombinant plasmid |
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| 图 4 pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒正向(A)及反向(B)测序结果 Fig 4 Sequencing results of the pEGFP-N1-TGF-β1 recombinant plasmid(A)forward and (B)reverse |
用质粒小量抽提试剂盒抽提pEGFP-N1-TGF-β1 重组质粒和pEGFP-N1空质粒，采用Nanovue 超微量分光光度计测浓度，pEGFP-N1-TGF-β1 重组质粒和pEGFP-N1空质粒浓度分别为195.5 μg/mL和204.0 μg/mL。
2.5 原代培养AEC-Ⅱ电镜照片培养至48 h细胞呈圆形、椭圆形生长，细胞核较大，胞浆内具有特征性的板层小体，细胞膜表面存在微绒毛，部分细胞内开始有空泡形成，见图 5。
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| A图标尺5 μm，B图标尺2 μm 图 5 新生猪AEC-Ⅱ培养至48 h透射电镜照片 Fig 5 Transmission electron microscopic images of neonatal piglet AEC-Ⅱ cultured up to 48 hours |
转染后48 h在倒置荧光显微镜下观察EGFP表达，由于pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒为EGFP和TGF-β1基因融合表达载体，EGFP表达水平可代表TGF-β1基因表达水平。Lipofectamine 12 μL组转染后48 h可见细胞EGFP表达水平较Lipofectamine 6 μL组稍强(图 6)。
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| A:对照组光镜照片；B:Lipofectamine 2000 12 μL组；C:Lipofectamine 2000 6 μL组 图 6 转染后48 h倒置荧光显微镜下观察Lipofectamine 2000 12 μL组和Lipofectamine 2000 6 μL组细胞EGFP表达水平(×100) Fig 6 After transfected up to 48 hours, the expression level of EGFP was evaluated under fluorescence microscope and recorded with photographs(×100) |
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)为儿科临床常见的呼吸系统危重症，亦属全身感染性重度脓毒症(severe sepsis)[7]。目前ALI/ARDS的治疗包括对原发病的治疗，糖皮质激素等药物治疗，肺保护性通气支持治疗，外源性肺表面活性物质(PS)和吸入一氧化氮(iNO)，液体通气和体外膜氧合(ECMO)等，可以使成人及儿童患者生存率>70%[1]。但这些救治技术本身有局限性、应用不当或者对于毁损性肺损伤可能无效，因此仍需进一步研究其他有效治疗措施。细胞移植(cell transplantation)、基因疗法(gene therapy)以及将两者结合而产生的细胞-基因疗法(cell-based gene therapy)对ALI动物治疗作用现已成为国内外研究热点[8]。
文献中开展的移植细胞主要为骨髓基质干细胞(BMSCs)[9, 10]和胚胎干细胞(ESC)[11, 12]。由于BMSC和ESC移植后存在致纤维化作用和致瘤性[13, 14]，因此肺损伤时最理想的移植细胞是肺内源性干细胞，AEC-Ⅱ作为肺泡上皮祖细胞，在急性肺损伤后可以自身增殖并转分化为AEC-Ⅰ，Serrano-Mollar等[15]发现在肺纤维化大鼠模型中经气道移植基因转染后的AEC-Ⅱ，可减少肺间质胶原沉积和降低肺纤维化的严重度。AEC-Ⅱ移植入ALI动物模型肺内修复机制为：自身增殖并转分化为AEC-Ⅰ，移植AEC-Ⅱ可以补充肺内降低的肺泡上皮细胞数量，重建受损肺泡上皮结构，因此可以加快修复进程；AEC-Ⅱ可以合成和分泌PS，维持肺泡内气液表面低张力，从而改善呼吸功能；AEC-Ⅱ在移植部位定植改变肺内微环境，产生多种促肺泡发育增殖相关细胞因子可以对抗肺损伤时释放的大量促炎性细胞因子以及感染炎症导致肺泡毁损及发育阻滞[16]。
目前国内外开展的AEC-Ⅱ原代培养多为大、小鼠和人肺组织块培养等，由于采用人肺组织培养存在伦理学问题，从小型哺乳动物中获取细胞量较少、与人的种系相差较大且不利于后续进行大体生理和病理生理学研究，所以需要有肺组织容易获取和细胞产量高的动物替代。本研究开展猪AEC-Ⅱ原代培养的优势为：猪和人类在解剖学、生理学、组织学和生物化学方面均非常相似[17]，原代培养的猪AEC-Ⅱ形态和分泌蛋白结构及功能与原代培养的人AEC-Ⅱ基本相同，这可以通过在猪AEC-Ⅱ培养过程中采用的特异性标志物抗体可以在人AEC-Ⅱ中应用来进一步证实，已有研究证实人和猪肺泡上皮细胞的标志物完全相同[18]；猪肺组织相对容易获取、AEC-Ⅱ细胞得率高且便于采集活体生理学和病理生理学资料[19]。与从成年动物肺内分离获得的AEC-Ⅱ不同的是，从胎肺中分离的AEC-Ⅱ增殖能力较高，另外其体外培养时转分化特征也与成年动物不同[20]，研究发现从幼年动物或损伤的肺组织内分离得到的AEC-Ⅱ均具有增殖功能[21]。故本实验选择新生猪作为研究对象，原代培养其AEC-Ⅱ，相对培养成年动物AEC-Ⅱ更具有能模拟人类新生儿和婴幼儿肺泡Ⅱ型上皮细胞特征的优势。
多种细胞因子和信号通路可改善ALI/ARDS转归：内皮型一氧化氮合酶(eNOS)[22]、抑制性-κB (I-κB)[23]、细胞生长因子如角化细胞生长因子(KGF)，肝细胞生长因子(HGF)，转化细胞生长因子-β(TGF-β)等[24]、血管生成素-1(Ang-1)[25]和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ[26]等。Bhaskaran等[4]的研究显示TGF-β1通过Smad通路可以通过改变蛋白表达调节细胞周期使AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ转分化，在急性肺损伤时可以改善肺泡气体交换能力，Buckley等[3]发现TGF-β1信号通路可以改善高氧性肺损伤大鼠的AEC-Ⅱ存活和修复能力，因此本实验选择构建TGF-β1- pEGFP-N1重组质粒，从而为进一步研究TGF-β1对体外原代培养AEC-Ⅱ生物学作用的影响及其机制提供了基础，也为构建其他对急性肺损伤结局有影响的细胞因子重组质粒提供了方法学基础。
绿色荧光蛋白(GFP)是一种来自海洋水母体内的生物发光物质，EGFP是GFP的突变体，其荧光强度是前者的100倍，在哺乳动物细胞中也更易表达。与其他荧光标记物相比，GFP的一个突出优点为GFP与目标基因融合后可在活细胞或生物体内动态表达，从而方便定位目标蛋白质的表达、分布及效应[27]。本研究将目的基因TGF-β1构建到pEGFP-N1质粒上，可以在荧光显微镜下直接观察到目的蛋白以及EGFP的表达。
本实验的不足之处在于采用脂质体介导方法转染原代AEC-Ⅱ效率较低，同时未检测基因转染后TGF-β1在细胞中的mRNA和蛋白表达水平。提高转染效率的方法包括：重复转染、采用Amaxa公司的Nucleofector细胞核转染技术进行转染[28]、构建重组腺病毒载体之后转染、脂质体介导转染后进一步使用流式细胞仪筛选EGFP表达阳性细胞等。本实验对比了Lipofectamine 不同剂量对细胞转染水平的影响，发现转染后48 h细胞EGFP表达水平Lipofectamine 12 μL较6 μL组表达稍强，提示需要对针对细胞种类进行多次转染以发现相对毒性小而转染效率高的最适比例。
本研究的意义在于首次将pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒转染入原代培养新生猪AEC-Ⅱ中，建立了重组质粒构建及转染原代培养AEC-Ⅱ方法，为开展其他对ALI/ARDS结局有影响的基因转染并为进一步研究实验性干预ALI的修复作用及转归提供方法学基础。
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