光气(phosgene)分子式为COCl₂，又名碳酰氯(carbonyl chloride)、氧氯化碳、氯代甲酰氯等，是一种无色窒息性剧毒气体，毒性比氯气大10倍，遇水缓慢分解成二氧化碳和盐酸。光气广泛应用于医药、农药、高分子材料的研究和生产中，常因防护不当或意外泄漏而发生中毒。光气暴露后可出现一系列以急性肺损伤(ALI)为主的临床表现，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)甚至导致死亡。目前有关光气中毒机制尚不完全清楚，焦点主要集中在“氧自由基和炎症反应”学说，但治疗上仍无特异性解毒药^{[1, 2, 3]}。

虽然糖皮质激素在ALI/ARDS治疗中的运用仍有很多争议，但一项系统综述提出更多的学者认为，在尚未有明确的有效治疗措施之前，糖皮质激素可早期使用于ALI/ARDS的治疗^[4]。课题组之前的研究表明，早期大剂量地塞米松干预能有效地保护大鼠光气吸入性ALI，可能的机制之一是抑制基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达^[5]，是否存在其他途径对光气吸入性ALI起保护作用在本次实验中进一步探讨。

血管生成素(angiopoietins，Angs)在肺泡毛细血管膜的损伤修复及肺水肿的形成和消散机制中起主要作用，其中Ang-1和Ang-2在ALI中的重要作用已倍受关注。笔者的前期研究提示在光气暴露后48 h内大鼠血清中的Ang-1水平呈持续性下降趋势，而Ang-2水平呈现上升趋势^[6]。近年来研究已证实Ang-1对各种原因引起的ALI有保护作用，其机制是能与内皮特异性酪氨酸激酶(Tie-2)受体结合，促使Tie-2磷酸化，磷酸化的位点结合下游的效应分子而产生生物学作用，从而减轻血管渗透性和抗炎症反应作用；同时Ang-2是Ang-1的天然拮抗剂，亦能与Tie-2结合，能促使内皮细胞激活,破坏内皮屏障功能,促进渗漏及炎症反应^{[7, 8, 9]}。因此，Ang-1表达水平的升高和Ang-2的降低，在减轻肺毛细血管渗漏和抗炎方面发挥重要作用。

本实验通过光气吸入性ALI大鼠动物模型，观察大剂量地塞米松对血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织中Ang-1,2和Tie-2水平的变化，探讨地塞米松干预对光气吸入性ALI的保护机制，为临床有效治疗光气吸入性肺损伤和评估肺损伤程度及预后提供理论和试验基础。

清洁级健康SD雄性大鼠36只，体质量(200±60)g(上海市第二军医大学动物实验中心)，合格证号：2007000300594。

动态染毒柜(上海第二军医大学)、酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK-3，芬兰Thermo公司)、洗衣板(Wellwash 4 Mk2，芬兰thermo公司)、数字显示隔水式电热恒培养箱(PYX-DHS，上海跃进医疗器械厂)、离心机(TGL-168，上海安亭科学仪器厂)、移液枪(Thermo labsystems)，台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，水浴振荡器(丹麦Heto公司)。固体三光气(购于海宁中联化学有限公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，上海生工生物工程有限公司)，环己烷(上海生工生物工程有限公司)，牛血清白蛋白(美国sigma公司)，地塞米松磷酸钠注射液(天津药业焦作有限公司，每支5 mg/2 mL)，Ang-1和Ang-2 ELISA试剂盒(武汉USCNK公司)，RT-PCR反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)，Ang-1,2和Tie2抗体(美国Santa Cruz公司)，内参GAPDH(美国Santa Cruz公司)。

2 g固体三光气溶于5 mL环己烷中配成质量分数为40％三光气，置于染毒柜中，20 mL DMF滴定使之产生光气。将SD大鼠随机(随机数字法)分为正常对照组、光气染毒组、地塞米松处理组，每组12只大鼠。正常对照组：吸入与光气染毒组同等流量的空气，未注射任何药物。光气染毒组：吸入8.33 mg/L的光气(纯度为100%)，未进行药物干预。地塞米松处理组：予染毒前1 h尾静脉注入地塞米松2.5 mg/kg，并给予同等剂量的光气吸入。实验大鼠置于染毒柜内，动态染毒5 min。染毒2 h后,观察大鼠一般情况的变化，将实验大鼠用质量分数为20%的乌拉坦腹腔注射(1.2 mL/kg)麻醉，心脏穿刺取血并放血处死动物。

大鼠处死后,每组随机取一只大鼠的一叶左肺，常规制作10%多聚甲醛固定,低温石蜡包埋、切片，HE染色，在光学显微镜下观察肺组织的病理学改变。

开胸取出大鼠右下肺脏，称湿质量后，置烤箱(80 ℃，48 h)烤至恒重，称干质量，计算肺组织湿干质量比值(W/D)。

每组大鼠右上肺叶都经右支气管穿刺插管，用注射器吸取冰生理盐水(4 ℃)5 mL，通过气管导管以较小的压力将生理盐水缓慢注入右上肺，回抽灌洗液，如此反复抽注，直至灌洗液总量达到15 mL，用血球计数板涂片细胞计数。将所得灌洗液离心(1 000 r/min，10 min)将上清液收集于15 mL离心管中，-80 ℃冻存，上清液进行蛋白量测定。

采用双抗体夹心酶标免疫分析法(ELISA法)测定血清和BALF中Ang-1和Ang-2的表达。操作步骤严格按照各试剂盒说明书步骤进行。酶标溶解度波长以450 nm读取吸光度值，按标准曲线计算对应的吸光度值。

各组大鼠中随机选取每组6例左肺组织。按照Trizol Reagant试剂制造商提供的步骤进行总RNA提取实验，并运用Primer Premier 5结合Dnastar分析软件及网上BLAST分析，设计并合成引物。Ang-1:Sense:5’ -CCAAGGGTCGGGATGCCAGATA-3’,Antisense:5’ -CTCCGTAAGGGCTTCCATTCGC-3’;Tie2:Sense:5’ -ATGTATGGTCCTATGGTGTATTG- 3’,Antisense: 5’ -CCTCCAGCATTGTCTCATTAG-3’;Ang-2:Sense:5’ -GTCAACACCTTTATCCATGA CACCA-3’,Antisense:5’ -GCAAGTGGTGACCTGGAAGTGAG-3’;GAPDH:Sense:5’ -CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’,Antisense:5’ -CCATCCAGCAGTCTTCTGAGT-3’。每个样本均做3复孔，取均数。

左肺部分组织剪切成细小的碎片。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L。按照20 mg组织加入100 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。充分裂解后，10 000 g离心5 min，取上清液，即可进行后续操作。根据标准曲线计算出蛋白浓度。将准备好的样品液和蛋白质Marker上样。使用BioRad电泳装置电泳。新鲜配制封闭液：在TBST中加入脱脂奶粉至终浓度为5%(w/v)，封闭时，将膜浸入到封闭液中，室温下振荡1.5 h。加入稀释好的Ang-1,2和Tie2一抗抗体，室温振荡孵育膜2 h。洗膜液洗膜3次(每次5 min)。加入稀释好的Ang-1,2和Tie2二抗抗体，室温1 h振荡孵育。洗膜液洗膜3次(每次5 min)。洗涤完毕后，去除洗涤液，滴加约适量TMB显色液充分覆盖膜。室温避光孵育30 min，直至显色至预期深浅，直接拍照记录。

所有的数据均用Gradpad 5软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用方差分析(组间两两比较采用LSD-t检验)和Student-Newman-Keruls检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

各组大鼠的一般情况、肺组织病理形态学及组织学观察^[5]：3组大鼠的体质量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。大鼠在实验过程中无死亡。光气染毒组大鼠染毒后2 h活动能力明显下降，眼半闭，萎靡，蜷缩成一团，刺激不活动，并逐渐表现出厌食、竖毛、眼球下陷、呼吸急促，对外界刺激反应淡漠等。地塞米松处理组反应较差，萎靡，刺激可见有少许活动，偶尔可见饮水，亦有厌食、竖毛、活动度减少、呼吸急促，对外界刺激反应淡漠等，但明显较光气染毒组轻。正常对照组活动正常，自由活动、摄食、饮水。各组大鼠肺组织病理形态学及组织学观察：(1)肉眼观察,正常对照组无明显损伤，肺组织表面光整；光气染毒组肺脏体积增大呈暗红色，边面有片状或放射状半透明区，见弥漫性充血、水肿；地塞米松处理组肺脏的充血水肿呈局灶性。(2)镜下观察病理改变,正常对照组肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎性细胞的浸润；光气染毒组肺泡壁明显充血、增厚，肺泡壁和肺间质内可见较多白细胞的浸润以及肺泡结构的破坏；地塞米松处理组可见大鼠肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性细胞浸润。提示成功复制光气吸入性ALI模型且模型稳定，满足实验所需。

各组大鼠肺湿/干比值(W/D)及BALF中中性粒细胞数(leukocytes)和蛋白含量的比较^[5]：采用常用的W/D来反映肺组织的含水量及肺水肿的程度，光气染毒组肺W/D明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；地塞米松处理组与正常对照组比较肺W/D无明显升高，差异无统计学意义(P>0.05)。正常情况下，BALF中细胞数量及蛋白含量少，但光气暴露后BALF中可见大量粒细胞并伴随蛋白含量的增加，这与局部炎症反应密切相关。与光气染毒组比较，地塞米松处理组BALF中中性粒细胞数和蛋白含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组的BALF中中性粒细胞数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组BALF中蛋白含量无明显升高，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1。

1：正常对照组；2：光气染毒组；3：地塞米松处理组；与正常对照组比较，aP<0.01，bP>0.05；与光气染毒组比较，cP<0.01 图 1 各组肺湿干质量比(W/D)及BALF中中性粒细胞数和蛋白含量比较 Fig 1 Comparisons of wet/dry in lung and leukocytes and protein content in BALF among groups

图选项

与正常对照组比较，光气染毒组血清及BALF中Ang-1浓度明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组血清及BALF中Ang-1浓度明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组血清中Ang-1浓度明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；地塞米松处理组BALF中Ang-1浓度、血清及BALF中Ang-2浓度无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

与正常对照组比较，光气染毒组血清及BALF中Ang-2浓度明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组大鼠血清及BALF中Ang-2浓度明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组血清及BALF中Ang-2浓度无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

与正常对照组比较，光气染毒组肺组织中Ang-1和Tie-2 mRNA表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-1和Tie-2 mRNA表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组鼠肺组织中Ang-1和Tie-2 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表 2。

与正常对照组比较，光气染毒组肺组织中Ang-2 mRNA表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-2 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-2 mRNA表达量无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

与正常对照组比较，光气染毒组肺组织中Ang-1和Tie-2蛋白含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01，n=3)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-1和Tie-2蛋白含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01，n=3)。与正常对照组比较，地塞米松处理组鼠肺组织中Ang-1和Tie-2蛋白含量无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05，n=3)。见图 2。

1：正常对照组；2：光气染毒组；3：地塞米松处理组；与正常对照组比较，aP< 0.01，bP>0.05，cP<0.05；与光气染毒组比较，dP< 0.01，eP< 0.05 图 2 各组大鼠肺组织中Ang-1,2和Tie-2蛋白含量的比较 Fig 2 Comparisons of levels of Ang-1,2 and Tie-2 in lung of rats among groups

图选项

与正常对照组比较，光气染毒组肺组织中Ang-2蛋白含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01,n=3)。与光气染毒组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-2蛋白含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05，n=3)。与正常对照组比较，地塞米松处理组大鼠肺组织中Ang-2蛋白含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05，n=3)。见图 2。

ALI/ARDS的发病机制目前比较公认的观点是炎症反应学说^[10]，机体应激后产生广泛而过度的炎症反应，炎性细胞及其释放的炎症介质和细胞因子最终引起肺泡毛细血管损伤，通透性增加和微血栓形成，肺泡上皮损伤，表面活性物质减少或消失，导致肺水肿，肺泡内透明膜形成和肺不张，从而引起肺的氧合功能障碍，导致顽固性低氧血症。有关光气中毒引起的ALI机制有“氧自由基”、“炎症反应”、“酰化作用”和“肺泡Ⅱ型上皮细胞中毒损伤”等众多学说，但均不能完满解释光气中毒的肺损伤机制。研究表明在光气吸入致肺损伤的动物模型中，最具特征性的病理变化为肺泡毛细血管膜损伤，通透性增高，渗漏增加，细胞及富含蛋白的液体渗出至肺组织间质、肺泡腔，表现为炎性渗出、肺水肿^[1]。笔者前期研究建立的大鼠光气吸入性ALI动物模型亦有上述改变，证实复制大鼠光气吸入性ALI模型成功^[5]。

目前大部分学者认为，光气中毒后尽早使用激素可减轻炎症反应导致脏器的进一步损伤^[2]，但有学者认为激素的作用尚未肯定^[11]。Grainge和Rice^[2]的系统综述提出早期(<6 h)或更早(<1 h)或高剂量静脉注射类固醇或更高剂量吸入类固醇是否是有效还需要进一步研究探讨。本实验采用在光气染毒前使用大剂量静脉注射地塞米松处理，观察其有效性。笔者观察到肺W/D及BALF中中性粒细胞数和蛋白含量较光气染毒组明显降低，提示大剂量地塞米松预处理对大鼠光气吸入性肺损伤有明显保护作用。

血管生成素(Angs)是一种存在于血清中的蛋白，Angs家族编码4种结构相似的蛋白质，其家族成员包括Ang-1、Ang-2、Ang-3(小鼠)和Ang-4，均能识别同一受体Tie-2，但效应不同，其中Ang-1和Ang-4能激活Tie-2，而Ang-2和Ang-3则有拮抗Ang-1的功能。众所周知Ang-1，2与Tie-2的表达均与肺毛细血管通透性改变和血管渗漏有关。在高氧引起的肺损伤中，Ang-l通过调节炎症介质IL-1、IL-4、TNF-α表达，减少血管渗漏，减轻肺损伤^[12]。将Ang-2直接作用于健康小鼠，发现Ang-2可导致肺血管充血渗漏，且ARDS发生率增加^[13]。笔者的前期实验发现，光气染毒后，大鼠血清中Ang-2及Ang-2/Ang-1比值与肺脏损伤指标呈正相关，Ang-1与肺脏损伤指标呈负相关^{[6, 14]}；同时使用腺病毒重组血管生成素-1(Ad.Ang-1siRNA)干预可以一定程度上缓解光气引起的急性肺损伤，提示外源性的Ang-1可减少肺泡灌洗液中的粒细胞数和肺湿/干质量比，并下调某些炎症因子如IL-1β，IL-17等的表达^[9]。因此，Ang-Tie-2系统在光气吸入性ALI中发挥重要的作用，其中Ang-1具有稳定血管、拮抗炎症介质所致的血管渗漏以及局部抗炎作用，而Ang-2则导致肺毛细血管通透性增高引起血管渗漏和炎症反应。

本实验结果显示，光气吸入后2 h，Ang-1和Tie-2水平明显降低，Ang-2水平明显升高。由于光气中毒后可引起肺组织的直接损伤和间接损伤，所以Ang-1,2和Tie-2的改变考虑与光气吸入后对肺血管内皮细胞的直接损伤和机体由此而引发的一系列反馈机制导致的间接损伤有关，进一步提示Ang-1，2和Tie-2之间的关系在维持血管稳定，血管渗漏和抗炎中的重要地位。地塞米松处理组血清、BALF和肺组织中Ang-2浓度明显降低，而Ang-1和Tie-2浓度明显升高，提示地塞米松可通过下调Ang-2的表达，同时上调Ang-1和Tie-2的表达，使肺泡毛细血管膜损伤减轻，通透性降低，渗漏减少，炎症反应减轻从而达到肺保护作用，这可能是其减轻光气吸入性急性肺损伤的重要机制之一。

本实验证据提示大剂量地塞米松预处理对光气吸入性ALI有保护作用，但de Lange和Meulenbelt^[11]提出传统抗炎药物糖皮质激素针对化学源性吸入性ALI/ARDS的临床疗效尚未定论，适应证亦尚不清楚，需要更多的研究探讨。同时，本研究在给药的次序上仅做了先给激素再染毒，其临床意义有限，希望以后在给药时间上能进行多时点的研究。此外，地塞米松能引起股骨头无菌性坏死、消化道出血、继发感染、糖代谢紊乱等不良反应，在一定程度上限制了其临床使用。虽然前期研究提示乌司他丁对光气吸入性急性肺损伤有保护作用^[15]，但其是否可替代激素尚不清楚。因此，目前激素作为抗炎的经典药物在急性肺损伤中仍发挥重要的作用，如何选择糖皮质激素的种类，给药时机，最佳的剂量和疗程，合理的给药途径(静脉、局部还是联合)等诸多问题有待于进一步系统深入的基础和临床研究寻找答案，同时随着科学技术的发展，无明显不良反应的替代药物及基因干预等治疗途径有待于今后尽早开发。

志谢   感谢复旦大学附属金山医院中心实验室老师给予的实验技术指导。