近 20 年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂的广泛使用，艾滋患者的日益增多，器官移植及心导管手术的开展，真菌感染已成为重要的院内感染^{[1, 2]}。尽管新的抗真菌药物不断研发，但由于侵袭性念珠菌病发病凶险、确诊困难、病原体耐药、治疗不良反应较多及治疗费用较高，给国民健康和经济带来了沉重负担^{[3, 4]}。如何预防和及时有效地控制念珠菌感染已成为刻不容缓的公共卫生问题。

白色念珠菌是侵袭性念珠菌病中最主要的致病菌，可以引起口腔、上呼吸道、肠道和阴道等多处浅表性念珠菌病，也可以通过血液传播形成念珠菌血症^{[1, 5, 6]}。多数情况下，白色念珠菌以无害的形式(酵母相)共栖于人体黏膜表面，当机体免疫功能下降或菌群失调时，白色念珠菌大量繁殖并侵入宿主细胞引起机体疾病^{[1, 7]}。

近年来，已有大量学者在研究白色念珠菌的感染机制，并对其粘附、侵袭和宿主细胞破坏的机制有了一定掌握^{[7, 8, 9]}。但目前的研究多数是针对单一白色念珠菌感染^{[7, 10, 11]}，而临床感染往往是伴随着多病原体共存的复杂感染。因此，进一步研究多种病原体复合感染对白色念珠菌感染状态的影响对临床工作具有重大指导意义。

本研究通过构建白色念珠菌和致病大肠杆菌共同感染离体肠上皮细胞的模型来研究共同感染对白色念珠菌感染状态的影响。通过倒置显微镜观察感染早期发生侵袭的白色念珠菌特征；通过测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性评估上皮细胞被破坏程度；通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测感染相关基因表达情况。

本研究所用病原菌为白色念珠菌标准株ATCC10231(便诊生物科技有限公司，南京，中国)和致病大肠杆菌O157:H7(士峰生物科技有限公司，上海，中国)。引物序列ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)^[12]用于白色念珠菌菌种确认。

白色念珠菌培养选用YPD培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨和2%葡萄糖)常规培养48 h。致病大肠杆菌培养选用LB培养基(0.5%)酵母提取物、1%胰化蛋白胨和1%氯化钠)常规培养10 h。病原菌在使用前采取平板活菌计数并定量稀释到2×10⁶ CFU/mL。

1.2 离体肠上皮细胞培养

离体肠上皮细胞选用肠腺癌来源Caoc-2细胞(中国科学院细胞库，上海，中国)，该细胞可在体外表现出特征性的肠上皮细胞分化。细胞培养液选用DMEM+10%胎牛血清 (Invitrogen Gibco,USA)，不含双抗，培养在37 ℃和5% CO₂浓度的温箱环境中。上板前进行细胞计数，12孔板每孔约加入1 mL细胞密度为1×10⁵ 个/mL，隔天换液。细胞生长至高密度时(约铺满80%~90%孔板)再次换液后用于实验。

根据不同的感染条件将实验组分为5组。组1为单纯白色念珠菌感染，即用1 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL白色念珠菌感染Caco-2细胞；组2为单纯致病大肠杆菌感染，即用1 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的致病大肠杆菌感染Caco-2细胞；组3为同时共同感染组，即用0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的白色念珠菌和0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的致病大肠杆菌感染Caco-2细胞；组4为白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组，即用0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的白色念珠菌感染Caco-2细胞6 h后接种0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的致病大肠杆菌；组5为致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染，即用0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的致病大肠杆菌感染Caco-2细胞6 h后接种0.5 mL浓度为2×10⁶ CFU/mL的白色念珠菌。其中组1、组2为单纯感染组，组3、组4、组5为共同感染组。组6为空白对照组，只含Caco-2细胞，不加入任何病原菌。

实验组和对照组在实验开始之前都将置换新的细胞培养液，常规培养在37 ℃和5% CO₂的温箱环境中。

实验组在感染后每隔30 min取样一次，移走待测样本细胞培养液后用PBS冲洗3次以充分去除未侵袭的白色念珠菌，最后用80%酒精固定40 min后通过倒置显微镜直接观察Caco-2细胞表面白色念珠菌侵袭情况。

本研究采用LDH检测试剂盒(Roche,Indianapolis,USA)，通过分光光度法检测从细胞中释放到培养液中的LDH的活性实现对细胞破坏程度的定量分析。实验组和对照组均在感染后第24小时小心吸取细胞培养液，离心后检测LDH活性。每个样本做3次复孔，非同代细胞进行2次重复试验。细胞破坏程度计算公式为：实验组LDH活性-对照组LDH活性。

收集感染后24 h样本于1.5 mL离心管中，并浸泡在液氮中冰冻。在冰冻条件下加入500 μL Buffer RB/ β-巯基乙醇。接着按顺序加入水饱和酚、2mol/L NaAc (pH 4.0)和氯仿裂解细胞。最后按真菌RNA提取试剂盒 (Omega，Norcross,USA) 说明完成RNA提取。

使用cDNA合成试剂盒(Takara,JP)合成cDNA。根据说明书，将8 μL RNA混合2 μL cDNA合成酶，置于37 ℃水浴15 min。然后置于80 ℃干浴锅10 s终止酶反应。

本研究将用到以下引物：ACT1^[13]、ALS3^[14]、PLB1^[15]和SAP4^[16] (表 1)，其中ACT1是内参基因^[13]，用于校正并计算目的基因倍数关系。

SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara,JP)用于qRT-PCR检测。根据说明，取10 μL SYBR Premix Ex Taq、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL cDNA 和7 μL去离子水，混匀。qRT-PCR反应条件为：94 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循环40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s产生溶解曲线。每个样本设置一个对应的空白对照组，每个样本做3次复孔，非同代细胞进行3次重复试验。mRNA相对表达量计算使用2^-△△Ct法。

1.7 统计学方法

采用SAS 9.4软件包进行数据统计分析。对LDH活性值及白色念珠菌致病相关基因表达量采用方差分析比较进行不同感染组之间的比较，对于组间有差异的数据进一步采用Bonferroni法进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

倒置显微镜下直接观察到侵袭的白色念珠菌特征，发现同时共同感染组(组3)在感染后30 min即出现白色念珠菌侵袭(图 1A)，而单纯白色念珠菌感染组(组1)最早于感染后1 h发现白色念珠菌侵袭(图 1B)(该结果相关论文在投)。致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组(组5)，同样在感染后30 min就可以发现侵袭的白色念珠菌，多数成簇状出现在侵袭部位(图 1C)。但是，随着感染时间的延长，各实验组之间显微镜观察结果并未见明显区别，均表现为真菌量随感染时间的延长而增加，并均在感染后2~3 h出现伪足相，3~4 h出现菌丝相，呈簇状生长(图 1D)。

A：同时共同感染组在感染后30 min可见白色念珠菌(红色箭头)侵袭，部分呈簇状分布；B：单纯白色念珠菌感染组在感染后1 h可见白色念珠菌(红色箭头)侵袭；C：致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组在感染后30 min可见白色念珠菌侵袭，成簇出现在侵袭部位(红色箭头)；D：致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组在感染后12 h，局部可见大量菌丝状白色念珠菌成簇聚集生长，周边酵母相白色念珠菌分布(红色箭头)。 图 1 倒置显微镜下观察白色念珠菌感染特征(10×20) Fig 1 Characteristics of C. albicans infection under inverted microscope (10×20)

图选项

LDH检测结果显示：不同感染组之间LDH活性值不同(F=71.18，P<0.01)。进一步进行组间两两比较，结果提示：同时共同感染组(组3)LDH活性最高(与组1、组2、组4、组5比较F值分别为14.48、5.48、11.74、3.45，P值分别为P<0.01、P=0.01、P<0.01、P=0.019)，致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组(组5)和单纯致病大肠杆菌感染组(组2)之间LDH活性值差异无统计学意义(F=2.03，P=0.54)，白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组(组4)和单纯白色念珠菌感染组(组1)之间LDH活性值差异无统计学意义(F=2.7，P=0.11)，组5、组2 LDH活性值大于组1、组4(P＜0.05)。(图 2)。

组3＞组5、组2＞组4、组1(n=6) 图 2 感染后24hLDH活性值 Fig 2 LDH activity at 24 hours after infection

图选项

qRT-PCR检测白色念珠菌致病相关基因表达调控情况。结果显示：相对于空白对照组，实验组ALS3、PLB1和SAP4均上调(所有-△△Ct值＞2)。对于ALS3基因，组1、组3、组4和组5之间差异无统计学意义(P=0.063 9)。PLB1基因表达组3高于组1(P=0.014 3)，其余各组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。SAP4表达组3、组5高于组1(P值分别为0.027 2、0.001 8)，其余各组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。(图 3)。

ALS3基因四组之间差异无统计学意义(P=0.063 9)；PLB1基因表达组3高于组1(P=0.014 3)，其余各组之间差异无统计学意义(P>0.05)；SAP4表达组3、组5高于组1(P值分别为0.027 2、0.001 8)，其余各组之间差异无统计学意义(均P>0.05) 图 3 mRNA相对表达量 Fig 3 mRNA relative expression at 24 hours after infection

图选项

近年来，白色念珠菌发病率呈逐年上升的趋势，越来越多的学者研究并报道白色念珠菌的致病机制^{[7, 17, 18]}。但多数研究重点关注单纯白色念珠菌感染的情况，本研究根据多致病菌混合感染的临床感染特点，研究致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染对白色念珠菌侵袭和破坏宿主细胞能力的影响。

通过倒置显微镜观察，发现共同感染组在白色念珠菌感染后30 min出现上皮细胞侵袭，早于单纯白色念珠菌感染组，提示共同感染在感染早期能够加速白色念珠菌对上皮细胞的侵袭。这一结果与Alves等^[15]和Silva等^[19]的研究类似，他们发现白色念珠菌与光滑念珠菌共同感染的情况下，发生侵袭的白色念珠菌量会增加。本研究进一步改变共同感染顺序，即先用致病大肠杆菌感染6 h后接种白色念珠菌，发现最早也是于感染后30 min发生上皮细胞侵袭。但无论是同时发生共同感染还是继发白色念珠菌感染，白色念珠菌形成伪足相和菌丝相的时间和单纯白色念珠菌感染是一致的，而菌丝相的形成被认为与白色念珠菌侵袭能力直接相关^{[20, 21]}。因此，笔者推测共同感染并不影响白色念珠菌菌丝相的形成，也就是不改变白色念珠菌本身的侵袭能力。但共同感染能够促使白色念珠菌更早发生侵袭，其可能的机制是致病大肠杆菌对上皮细胞的破坏使得白色念珠菌容易在破坏处发生侵袭。

在感染后24 h，上皮细胞破坏检测结果为同时共同感染组高于单纯致病大肠杆菌感染和单纯白色念珠菌感染，提示共同感染增强了白色念珠菌对上皮细胞的破坏。而3组共同感染组之间进行比较，发现同时共同感染组的LDH活性＞致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组＞白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组。因此，笔者认为致病大肠杆菌和白色念珠菌之间存在潜在的协同关系，能够增强致病菌对上皮细胞的破坏，并且增强的程度是受致病菌发病顺序和共存时间长短的影响。

本研究进一步从基因角度评估共同感染对白色念珠菌致病性的影响。所采用的ALS3基因与白色念珠菌菌丝形成和侵袭相关^{[22, 23]}，水解酶编码基因PLB1和SAP4也是已知的与白色念珠菌破坏细胞的功能直接相关的基因^{[24, 25, 26]}。结果显示所有参与检测的实验组相对于空白对照组，ALS3、PLB1和SAP4均上调，证明了这3个基因参与了白色念珠菌的致病过程，与之前的研究结果一致^{[22, 23, 24, 25, 26, 27]}。笔者在此基础上进行实验组之间的对比，PLB1和SAP4基因表达情况验证了LDH活性检测结果，即共同感染增强了白色念珠菌的致病性，并且增强的程度是受参与共同感染的致病菌发病顺序和共存时间长短影响。Alves等^[15]曾报道白色念珠菌与光滑念珠菌共同感染时ALS3基因显著上调，但在本研究中ALS3基因表达情况则为四组之间差异无统计学意义，其可能的原因是本研究所选择的基因检测时间点为感染后24 h，在该时间点大量白色念珠菌已转变为菌丝相，而ALS3基因被认为与白色念珠菌菌丝形成和侵袭相关^{[22, 23]}，所以四组之间差异无统计学意义。

综上所述，本研究结果提示致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染增强了白色念珠菌的侵袭力和破坏性，并且增强的程度与两种菌的发病顺序和共存时间长短有关。