中华急诊医学杂志  2015, Vol. 25 Issue (5): 659-662
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曾文新, 黄园, 邓郁, 温妙云, 韩永丽, 钟文宏, 曾红科. 真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测在重症肺炎患者中真菌检测的临床价值[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(5): 659-662.
Zeng Wenxin, Huang Yuan, Deng Yu, Wen Miaoyun, Han Yongli, Zhong Wenhong, Zeng Hongke. Clinical evaluation of the (1, 3)-β-D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in severe pneumonia patients[J]. Chin J Emerg Med, 2016, 25(5): 659-662.
真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测在重症肺炎患者中真菌检测的临床价值
曾文新, 黄园, 邓郁, 温妙云, 韩永丽, 钟文宏, 曾红科     
510080 广州，广东省人民医院 广东省医学科学院急危重症医学部(曾文新、温妙云、韩永丽、钟文宏、曾红科)；
999077 香港，香港大学内科系神经内科(黄园)；
510080 广州,广东省人民医院 广东省医学科学院协和高级医疗中心(邓郁)
收稿日期：2016-02-27
基金项目：国家重点专科建设项目(2012-649)；广州市急危重症临床医学研究与转化中心项目(155700027)；国家自然科学基金(81272150)
通信作者：曾红科，Email: zenghongke@vip.163.com
摘要：目的 探讨真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)在重症肺炎患者中侵袭性真菌检测的临床价值和意义。 方法 选择广东省人民医院2014年11月至2015年11月入住内科重症监护病房(MICU)及急诊重症监护病房(EICU)的重症肺炎患者558例，按2007年美国胸科学会(ATS)和美国感染病学会(IDSA)有关重症肺炎的诊断标准进行确诊，采集入住当天的血标本，使用真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)试剂盒进行检测，G试验结果在0~100.5 pg/mL为阴性；根据重症肺炎患者血培养检测分为阳性患者组与阴性患者组。采用SPSS 21.0进行统计学分析，以ROC曲线判断G试验敏感度和特异度，非参数检验方法得出真阳性率和假阴性率。 结果 在558例研究对象(女185例，男373例，平均年龄64.7岁)中，真菌培养结果阳性为41例，G试验平均值在阳性患者和阴性患者中分别为(568.53±796.57)pg/mL、(51.4±63.27)pg/mL，阳性患者显著高于阴性患者(P＜0.05)。G试验敏感度、特异度、真阳性率、假阴性率分别为92.7%、92.5%、49.4%和0.6%。 结论 真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒对重症肺炎患者早期诊断真菌感染具有较高临床价值。
关键词： (1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)     重症肺炎     侵袭性真菌感染    
Clinical evaluation of the (1, 3)-β-D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in severe pneumonia patients
Zeng Wenxin, Huang Yuan, Deng Yu, Wen Miaoyun, Han Yongli, Zhong Wenhong, Zeng Hongke     
Departmeny of Emergency & Critical Care Medince,Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China(Zeng WX,Wen MY,Han YL,Zhong WH,Zeng HK);
Department of Medicine, University of Hong Kong, Hong Kong 999077, China(Huang Y);
Department of Concord Medical Center, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China(Deng Y)
Corresponding author: Zeng Hongke, Email: zenghongke@vip.163.com
Fund program: National Clinical Key Subject Construction Project (2012-649); Project of Emergency & Critical Care Medicine Clinical Research and Transformation Center of Guangzhou (155700027); National Natural Science Foundation of China (81272150)
Abstract:Objective To explore specimen sampling for microbial culture in ICU patients with documented infections in order to offer clinical evidence for improving the rational use of antibiotics.Methods Patients with documented infection on the first day after admission into ICU and discharged from ICU from July to December 2012 and from July to December 2013 were enrolled in the study. Clinical data including presence or absence of infection, initial antimicrobial therapy，microorganism specimen sampling and culture were retrospectively analyzed.Results Of 841 patients discharged from ICU, 443 had evidence of infections and received antimicrobial therapy on the admission day, and only 30 (6.8%) of them had microbiological detection results prior to treatment. There were microbial specimens available at infection sites on the admission day in 369 cases, and 360 cases(97.6%)of them were sampled in the first three days after ICU admission, while only 119 cases(33.1%)were sampled before the first dose of antimicrobial therapy. Specimens sampled were sputum (56.4%) in the majority, followed by the blood (17.4%). Further analysis of 269 infected patients receiving initial broad-spectrum antimicrobial therapy also showed that only 33.5% cases were sampled before the first dose of broad-spectrum antimicrobial administration. The positive isolation rate of multi-drug resistant isolates including A. baumannii, S. maltophilia and B. cepacia from specimens sampled after first dose of initial broad-spectrum antimicrobial therapy were significantly higher than those sampled before antimicrobial therapy, P<0.05. There was no significant difference in isolation rate of Staph. aureus and Enterobacteriaceae between samples obtained before and after first dose of initial broad-spectrum antimicrobial therapy. Conclusions Few evidence of pathogenic microorganisms was available before initial antimicrobial therapy in ICU patients. Although sampling rate of microbial specimens is high, the most of them are sampled after the first dose of antimicrobial administration, and the patentially contaminated specimens such as sputum in predominance, obviously decrease the reliability of authentic results obtained from microorganism culture.
Key words: Intensive care units     Serious infection     Anti-bacterial agents     Specimen sampling     Microorganism    

侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)发病率逐年上升，并已成为患者危重症发展的主要威胁因素，病死率高(30%~80%)[1]。重症监护病房(ICU)中，由于IFI 而引起的重症肺炎十分常见[2]。然而，由于重症肺炎患者临床表现大致相同[3]，并且IFI的确诊通常需要侵入性的组织标本，而侵入性的操作过程常因患者的病情所限难以实施。尸检研究发现，高达75%的IFI 病例在生前漏诊[4]。因此，早期准确快速简便地诊断和治疗IFI，是目前临床各科室高度重视，并且迫切需要解决的关键问题。真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)对真菌早期诊断已逐渐得到认可，然而，其在重症肺炎患者中的临床价值仍然未知。本研究采用真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)试剂盒快速检测患全血(1，3)-β-D葡聚糖水平，通过与金标准[5]真菌培养结果作对比，探讨真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒对重症肺炎患者诊断真菌感染的敏感度和特异度，以及其临床应用价值。

1 资料与方法 1.1 一般资料

2014年11月至2015年11月入住广东省人民医院MICU(内科重症监护病房)及EICU(急诊重症监护病房)的558例使用呼吸机的重症肺炎患者，纳入患者标准按2007年美国胸科学会(ATS)和美国感染病学会(IDSA)有关重症肺炎的诊断标准进行筛选，排除起病以来已使用抗真菌药物的患者。其中女性185例，男性373例，年龄19~94岁，平均64.7岁，肺炎严重指数(PSI)评估Ⅴ级(＞130)。采集入住当天的静脉血标本进行检测，根据重症肺炎患者血培养结果，将其分为两组：真菌阳性患者组、阴性患者组(血培养结果为细菌或阴性)。

1.2 仪器和试剂

广东省湛江安度斯生物有限公司生产的真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测(G试验)试剂盒、LKM动态试管检测仪、75 ℃试管恒温仪、旋涡混合器、低速离心机、无热原吸头、移液器、塑料试管架、无热原真空采血管(肝素抗凝剂)、血平板、巧克力平板。

1.3 研究方法

(1)真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测：用配套采血管采集静脉血1~2 mL,置400 g离心10 min；然后取0.1 mL分离的血清/血浆加入样品稀释瓶中，混匀；接着置样品稀释瓶于75 ℃保温10 min后冷却至室温，即得血清/血浆稀释液。启动生物探针检测软件，使其进入待采集状态。然后吸取0.25 mL试剂复溶液加入反应试剂中，轻轻摇匀，得试剂溶液。取反应试管，每样平行2管，分别加入50 μL试剂溶液。然后分别加入100 μL血清/血浆稀释液。将加样后的反应溶液混匀后，插入LKM动态试管检测仪中进行反应。75 min后反应完毕，检测软件将自动处理数据，计算出样品供试溶液中的(1，3)-β-D葡聚糖测量值。判断标准：G试验结果在0~100.5 pg/mL为阴性；结果＞100.5 pg/mL为阳性。

(2)真菌培养：抽取血液进行G培养的同时，留取患者血液标本进行真菌培养。标本的留取和真菌分离培养均按照《全国临床检验操作规程》第三版进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0进行统计学分析。G试验结果＞100 pg/mL为阳性结果，G试验结果为0~100 pg/mL为阴性结果。计量资料采用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用ROC曲线检测G试验对于对早期诊断真菌感染的敏感度和特异度。采用非参数分析真阳性率、假阴性率。

2 结果 2.1 真菌培养及G试验结果

从表 1可知，558例重症肺炎患者，真菌培养结果为阳性41例，阴性517例。G试验平均值在阳性患者和阴性患者中分别为(568.53±796.57)pg/mL、(51.40±63.27)pg/mL。阳性患者G试验值显著高于阴性患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)。G试验结果为阳性患者共77例，其中真阳性患者38例，G试验真阳性率为49.4%。G试验结果为阴性患者共481例，其中假阴性患者3例，假阴性率为0.6%。

表 1 真菌培养及G试验结果Table 1 The result fungus culture and G-test
真菌培养 例数( n=558) G试验结果(x±s，pg/mL) 阳性( n=77)(例，%) 阴性( n=481)(例，%)
阳性 41 568.53±796.57a 38(49.4) 3(0.6)
阴性 517 51.4±63.27 39(50.6) 478(99.4)
注：a P<0.05
表选项
2.2 G试验结果敏感度和特异度

由图 1可知，以G试验值100.5 pg/mL为临界值，通过ROC曲线得出的G试验敏感度为92.7%，特异度为92.5%。曲线下面积(AUC)为0.957(95%CI：0.917~0.997)

图 1 G试验结果ROC曲线 Fig 1 The ROC Curve of G-test
图选项
3 讨论

重症肺炎一直占据感染性疾病病死率之首[6]，其重要原因之一病因的早期诊断困难，从而造成抗真菌治疗的延迟。患者传统真菌培养的方法耗时长，且取样的难度及限制性较大。因此，通过检测真菌细胞壁成分(1，3)-β-D-葡聚糖，该物质由人体的吞噬细胞吞噬真菌后而持续释放，在血液及体液中含量增高(浅部真菌感染无类似现象)，从而成为判断真菌感染的新途径。以往研究表明，G试验对于真菌治疗的早期诊断具有积极的临床价值[7]。但是由于重症肺炎患者感染途径多样，给药复杂，因而寻找敏感度、特异度、可信度高的G试验检测手段，是临床工作者进一步的工作任务，具有重要的临床意义。

本实验结果G值真菌感染阳性组[(568.53±796.57)pg/mL]显著高于阴性组[(51.4±63.27)pg/mL]，与之前的研究结果类似[8]。经ROC曲线检测得知，本研究使用的G试验试剂盒在设定临界点为100.5 pg/mL的情况下，AUC值0.957(95%CI：0.917~0.997)，可认为试验方法区分率较好[9]。敏感度92.7%，特异度92.5%，可认为有高敏感度及特异度[10]。与以往研究比较，本研究中得出的G试验敏感度及特异度均非常理想[11, 12, 13]。

在纳入的558例患者中，G试验结果阳性77例，真阳性38例，真阳性率为49.4%。G试验结果阴性为481例，假阴性为3例，假阴性率为0.6%。跟以往研究数据比较[14, 15, 16]，本研究假阴性率极低，而真阳性率并没有明显优势。本研究合理采用100 pg/mL作为临界点，提高检测手段的特异度，是降低假阴性率的一个主要原因。在真阳性率方面，本研究研究对象为重症肺炎患者，虽然采集入院时全血作为标本，但仍然不能排除患者入院前已被输入白蛋白、球蛋白、脂肪乳等会对G试验结果产生影响的药物，而造成假阳性。除此之外，不能排除一些患者患有细菌性败血症，而细菌性败血症也会造成试验结果假阳性。因此在临床工作中，为避免假阳性给疾病诊断和治疗带来误判断，一定要结合临床加以分析[17]，对高危人群进行动态监测。有必要时，可进行2次或2次以上G试验以降低假阳性率。之后的研究可以进一步探讨G试验次数对临床工作价值的意义，以及菌种对G试验结果的影响。

长期以来，临床上一直寻找可靠有效的真菌检测方法以弥补传统真菌培养法其取样难度大，培养时间长(一般需3~5 d)的缺陷。本研究证实，本研究采用的G试验检测方法，不仅快速(约2 h)、简便，且具有高度灵敏性和特异度。在重症肺炎患者中真阳性率高而假阴性率非常低，可为临床医生及时排除真菌感染，避免抗真菌药物过度使用。

综上所述，本研究所用G试验试剂盒可以保障重症肺炎早期诊断，指导临床合理用药，为治疗赢取宝贵时间，具有突出的临床价值。

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