2016, Vol. 25
急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是一组由冠状动脉内不稳定斑块(unstable plague)所引起危害极大的急性心肌缺血综合征[1]。MicroRNA(miRNAs)是一组高度保守的单链非编码小分子RNA,参与多种生物过程的调控，其中miRNA-21与动脉粥样硬化性疾病密切相关[2]。本研究旨在探讨冠心病(coronary artery disease,CAD)患者血浆miRNA-21水平与不稳定斑块的关系。
1 资料与方法 1.1 一般资料连续入选2012年1月至2014年12月在广州市第一人民医院心内科住院并诊断为CAD的患者100例，其中急性非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)9例，不稳定型心绞痛46例，稳定型心绞痛45例。入选的患者均接受冠状动脉造影(coronary angiography,CAG)及血管内超声(intravascular ultrasound,IVUS)检查后行经皮腔冠脉内介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)。另选取同期在本院体检中心进行健康体检的健康人群50例作为对照组。患者住院期间都接受标准的冠心病二级预防药物治疗，包括阿司匹林0.1 g/d、氯吡格雷75 mg/d双联抗血小板，若无禁忌均使用他汀、β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制物(ACEI)等药物。排除标准：⑴ 急性ST段抬高性心肌梗死(STEMI)需行直接PCI或溶栓再灌注治疗；⑵ 心源性休克或合并急性脑血管意外、消化道或泌尿系统出血；⑶严重肝肾功能不全、重症感染、血液系统或自身免疫疾病、恶性肿瘤；⑷ 合并瓣膜性心脏病或先天性心脏病者。
1.2 冠状动脉造影(CAG)Seldinger法穿刺桡动脉或股动脉为入路行选择性CAG，CAG在数字减影血管造影X线机(Philips Allura xper FD20)上进行，常规体位投照，必要时加照其他的特殊体位。
1.3 血管内超声法(IVUS)[3]冠状动脉造影后即刻注入肝素抗凝。使用iLab超声诊断仪(Boston Scientific,美国)以及Atlantis SR Pro冠脉超声成像导管(Boston Scientific,American)，直径为3.6 F，频率为40 MHz，超声探头导管在X线透视下沿导引钢丝进入冠状动脉。到达狭窄病变处远端后，自动回撤装置将导管以0.50 mm/s速度回撤，同时采集影像数据，录盘分析。分析方法严格按照美国心脏病学院的血管内超声检测指南。利用QIVUS iMap Basic Viewer 2.1软件构建组织图像，测定病变血管外弹力膜横截面积，管腔横截面积，斑块负荷及每种成分在斑块中所占比例，以评价靶病变的斑块性质。血管内横断面积狭窄率超过40%、坏死组织超过10%、且靠近管腔的斑块定义为不稳定斑块[4]。根据iMap-IVUS对斑块的检查将入选的CAD患者分为稳定斑块组(n=45例)和不稳定斑块组(n=55例)。
1.4 血液学标本的收集及血浆miRNA-21水平的检测血浆miRNA-21的检测[5]：患者均于入院后第2天清晨空腹抽取静脉血2 mL,健康对照组于体检当天上午8时左右空腹状态下留取静脉血标本,置于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)无菌抗凝试管中，2 h内分离血浆,血浆miRNA-21采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitive realtime fluorescent polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行检测(Promega公司，美国),以人snRNA U6(Human snRNA U6)为内参，定义△Ct=目的基因(miRNA-21)Ct-内参(U6)Ct；△△Ct=待测样本中目的基因(miRNA-21)△Ct-参照样本中目的基因(miRNA-21)△Ct，相对样本模板量RQ=2-△△Ct(Ct值的含义:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)。以相对样本模板量表示循环miRNA-21的相对表达量。
1.5 统计学方法应用SPSS13.0 统计软件进行统计分析，计量资料采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验对计量资料作正态性检验，正态分布的统计指标以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数的比较采用成组t检验，多组间均数的比较采用 One-way ANOVA方差分析(SNK-q检验)。计数资料用百分率(%)表示，率的比较采用χ2检验。采用受试者工作曲线(ROC)评价血浆miRNA-21相对表达量对CAD患者存在不稳定斑块的判断价值，采用多因素Logistic回归分析评价循环miRNA-21相对表达量对CAD患者不稳定斑块的预测意义。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 入选患者的一般资料本研究共纳入100例CAD患者，年龄(61.52±6.75)岁，男性57例，女性43例。稳定斑块组和不稳定斑块组在临床基线资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。
| 指标 | 稳定斑块组(n=45) | 不稳定斑块组(n=55) | t/χ2值 | P值 |
| 年龄(岁，x±s) | 61.76±7.54 | 61.26±6.72 | 0.274 | 0.675 |
| 性别(男/女) | 27/18 | 30/25 | 0.301 | 0.686 |
| 吸烟史(例，%) | 3(6.7) | 5(9.1) | 0.198 | 0.727 |
| 冠心病家族史(例，%) | 1(2.2) | 3(5.5) | 0.673 | 0.625 |
| 高血压(例，%) | 35(77.8) | 43(78.2) | 0.002 | 0.961 |
| 糖尿病(例，%) | 12(26.7) | 16(29.1) | 0.030 | 0.862 |
| BMI(kg/m2，x±s) | 24.67±3.22 | 24.36±3.15 | 1.346 | 0.256 |
| 白细胞(109 L-1，x±s) | 5.81±1.92 | 7.02±2.78 | -3.256 | 0.052 |
| 血肌酐(μmol/L，x±s) | 80.24±8.76 | 78.93±9.38 | 1.762 | 0.651 |
| CHOL(mmol/L，x±s) | 5.19±1.22 | 5.28±1.45 | -0.415 | 0.554 |
| LDL-c(mmol/L，x±s) | 3.72±1.35 | 3.70±1.54 | 0.432 | 0.722 |
| NT-proBNP(pg/mL，x±s) | 168.49±52.38 | 171.08±62.44 | -0.548 | 0.578 |
| NYHAⅡ级以上(例，%) | 5(11.1) | 6(10.9) | 0.001 | 0.971 |
| 多支血管病变(例，%) | 16(35.6) | 23(41.8) | 0.408 | 0.544 |
| B2/C型病变(例，%) | 11(24.4) | 12(21.8) | 0.096 | 0.814 |
| Gensini积分(x±s) | 35.15±8.26 | 37.15±7.89 | -0.745 | 0.566 |
| ACEI/ARB应用(例，%) | 32(71.1) | 44(80.0) | 2.228 | 0.151 |
| β-blocker应用(例，%) | 22(48.9) | 24(43.6) | 0.275 | 0.688 |
| 他汀应用(例，%) | 41(91.1) | 53(96.3) | 1.211 | 0.404 |
| 注：BMI 体质指数；CHOL 总胆固醇；LDL-c 低密度脂蛋白； NT-proBNP N末端脑钠肽前体；ACEI 血管紧张素转换酶抑制剂；β-blocker β受体阻滞剂 | ||||
采用荧光定量PCR技术检测三组患者清晨空腹静脉血浆miRNA-21的水平，结果显示不稳定斑块组CAD患者血浆miRNA-21水平显著高于稳定斑块组和对照组 。
2.3 血浆miRNA-21水平对CAD患者不稳定斑块的判断价值将入选CAD患者的血浆miRNA-21水平对患者是否存在不稳定斑块做出ROC曲线(图 1)，可见血浆miRNA-21的ROC曲线下面积(AUC)=0.869(95%CI：0.797～0.940)，表明通过血浆miRNA-21水平高低对判断CAD患者的是否存在不稳定斑块有相当的价值。
|
| 图 1 循环miRNA-21水平对不稳定斑块的ROC曲线 Fig. 1 The ROC curve of plasma miRNA-21 predicting the unstable plague in CAD patients |
采用多因素Logistic回归方法分析包括血肌酐(Cr)、低密度脂蛋白(LDL-c)、高密度脂蛋白(HDL-c)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、空腹血糖(FBS)、血浆miRNA-21相对表达量、血清可溶性CD40配体(sCD40L)水平等多个生化指标(因变量)与冠脉内斑块(应变量)是否稳定(有不稳定斑块为1；无不稳定斑块为0)之间的关系。见表 2。多因素Logistic回归方法分析显示血浆miR-21与炎症因子高敏C反应蛋白、血清sCD40L是CAD患者是否存在不稳定斑块的独立预测因子。
| 项目 | β | S.E. | Wald | P值 | OR值 | 95%CI |
| 血Cr | 0.421 | 0.515 | 2.143 | 0.298 | 1.167 | 0.621～1.543 |
| LDL-c | 1.382 | 0.614 | 2.552 | 0.098 | 1.865 | 0.776～2.104 |
| HDL-c | -0.885 | 0.467 | 1.485 | 0.202 | 0.911 | 0.546～1.205 |
| NT-proBNP | 0.758 | 0.398 | 0.702 | 0.457 | 1.022 | 0.505～1.331 |
| hs-CRP | 1.552 | 0.728 | 3.257 | 0.021 | 2.456 | 1.352～3.162 |
| Hcy | 0.636 | 0.643 | 1.542 | 0.086 | 1.358 | 0.798～1.856 |
| sCD40L | 0.982 | 0.353 | 4.020 | 0.015 | 2.309 | 1.588～3.365 |
| FBS | 0.432 | 0.336 | 1.223 | 0.553 | 0.894 | 0.661～1.256 |
| miRNA-21 | 1.785 | 0.421 | 4.557 | 0.011 | 3.125 | 2.126～5.235 |
近年来的研究报道循环miRNAs作为一类单链内源性非编码小分子RNA，其在患者生理或病理状态下的变化早于其他生物标志物，并且具有良好的抗RNA酶降解能力和较高的稳定性[6]，这就为血清/血浆miRNAs作为生物标记物进行检测提供了可能。以往的研究已发现miRNA-21与冠心病有着密切的关系[7]，但目前关于循环miRNA-21与动脉粥样硬化尤其是与不稳定斑块之间的关系尚未阐明。
本研究结果显示，不稳定斑块组CAD患者血浆miRNA-21的水平显著高于稳定斑块组的CAD患者和健康对照组患者。表明循环miRNA-21相对表达量与CAD患者是否存在不稳定斑块可能有一定关系。既往的研究已证实miRNA-21在许多主要的心血管细胞类型如血管平滑肌细胞(VSMC)、内皮细胞(EC)、心肌细胞和心脏成纤维细胞中均呈高表达，并在许多心血管疾病中亦存在异常差异性表达[8]，并与动脉粥样硬化有着密切的关系，但循环miRNA-21是否可以作为预示CAD患者不稳定斑块存在和ACS发作的关键生物学标志物，目前仍未见相应的研究报道。本研究结果中ROC曲线显示循环miRNA-21相对表达量对CAD患者是否存在不稳定斑块具有重要的判断价值。
动脉粥样硬化斑块形成的过程[9]为各种危险因素如高血压、糖尿病、吸烟、氧化修饰的低密度脂蛋白等对动脉内皮或动脉内膜造成功能性和解剖性损伤，脂质在巨噬细胞、平滑肌细胞积聚并侵入动脉内膜和中膜形成粥样斑块，涉及到内皮损伤、血管平滑肌迁移、增殖、炎症反应、血管新生等。研究发现miRNA-21参与血管内膜增值性疾病的病程。血管内皮或粥样硬化斑块损伤后，新生内膜形成是许多血管内增生性疾病如冠心病、周围血管疾病、血管成形术后再狭窄等的共同病理性损伤特征之一，也是血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡失平衡的结果。Ji等[10]应用基因芯片检测血管成形术后小鼠颈动脉部位miRNAs的表达谱，结果发现在差异性表达的miRNAs中，miRNA-21在颈动脉损伤部位的表达量是正常颈动脉的5倍，敲除过度表达的miRNA-21能明显抑制新生内膜的形成。体外研究亦发现，miRNA-21在低分化的VSMC中的表达量显著高于正常VSMC，抑制miRNA-21表达可明显降低VSMC增殖并促进其凋亡[11]。Werber等[12]研究发现血流的剪切力影响内皮细胞miRNA-21的表达，miRNA-21通过激活一氧化氮(NO)产生的通路影响血管内皮细胞的生物学功能进而影响受损血管内斑块的修复和受损血管段的重构。可见miRNA-21可通过调控VSMC增值、凋亡，以及影响内皮细胞的修复和生物学功能正常执行参与动脉粥样硬化的进程，导致不稳定斑块的形成。本研究结果还显示血浆miRNA-21与炎症因子高敏C反应蛋白(hs-CRP)及血清可溶性CD40配体(sCD40L)均是CAD患者不稳定斑块的预测因子，提示miRNA-21与不稳定斑块内的炎症反应可能存在一定关系，而炎症反应是动脉粥样硬化斑块形成及进展的最重要机制之一。
综上所述，冠心病患者血浆miRNA-21的水平可作为判断和预测冠状动脉内不稳定斑块形成的一种重要的血液学生物标志物。这将为今后对CAD患者病情的判断、治疗方案的选择及调整提供重要的实验依据。但本研究仍存在样本量偏小，研究的冠心患者群较单一等不足，在miRNA-21与炎症反应在致斑块不稳定的机制方面未做深入的研究探讨，因此，本研究结果和结论有待将来大规模的临床试验进一步验证。
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