云南是我国野生蘑菇资源最丰富多样的省份，部分毒蘑菇与食用菌外形相似，即使山区有经验的农民也可能误将毒蘑菇当作食用菌采集、出售或食用^[1]。云南是我国毒蘑菇中毒事件发生最多的省份，几乎每年都有因误食毒蘑菇而中毒甚至死亡的事故发生^[2]。2015年8月云南省南华县发生一起食用野生蘑菇中毒事件，4人中毒，无死亡，其中2人以意识障碍，抽搐为主要表现，现报道如下。

2015年8月2日约17时，南华县某村村民一家4人(祖父54岁，祖母53岁，孙女11岁，孙子7岁)共同食用蘑菇炒肉、青菜汤、米饭,蘑菇由祖母从自家附近山上采集，进餐过程未发现异常。食后2 h共同进餐4人皆出现头晕、呕吐等临床症状。其中孙女、孙子二人出现意识障碍、抽搐。2名症状严重的儿童患者转至楚雄彝族自治州人民医院，2名症状轻微的患者继续在南华县人民医院留院观察，48 h后病情明显好转给予出院。

进食蘑菇约2 h后，4名患者先后出现头晕、恶心、呕吐，其中2名患儿出现意识障碍，神志恍惚，呼之能睁眼，只能说单字，伴四肢阵发性抽搐，每次持续3～5 s。南华县人民医院给予洗胃、药用炭30 g鼻饲、输入西咪替丁、维生素C等。转送楚雄州人民医院急诊科后，2名儿童生命体征平稳，皮肤、巩膜无黄染，无皮下出血，瞳孔等大等圆、对光反射灵敏，心肺无异常体征，腹软，无压痛，肝脾未触及。经患者及家属描述和从图谱辨认，临床诊断为鹅膏菌中毒。相关检测指标见表 1。治疗经过：入院后2例患儿均给予水飞蓟宾、N-乙酰半胱氨酸、青霉素、西米替丁等，其中病例1给予了血液灌流治疗。住院3 d病情明显好转给予出院，12 d回院复诊恢复正常。

中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所调查人员在患者家属的带领下于患者住处附近山林采集蘑菇样品，经患者辨别确认其中2种为当日食用品种。对2种蘑菇样品进行形态学和分子生物学鉴定。

对现场采集的2种蘑菇标本进行形态学观察，第一种蘑菇样品(图 1a-c)经鉴定为小豹斑鹅膏(amanita parvipantherina)。宏观特征为：子实体中型，扁平至平展；菌盖表面淡黄褐色至浅黄色，中部色较深，至边缘颜色变浅，被菌幕残余；菌幕残余白色，易脱落；菌褶离生至近离生，白色；菌柄白色；菌环着生于菌柄上部，膜质，较小，白色；菌柄基部膨大，近球形，白色。显微结构：担子棒状(45～58)μm×(11～14) μm，具4小梗。担孢子(8.5～11.5) μm×(7～8.5) μm，宽椭圆形至椭圆形，非淀粉质。菌盖上的菌幕残余主要由纵向排列的菌丝构成。菌环主要由近辐射状、稀疏排列的菌丝组成，期间夹杂有较多的棒状膨大细胞。锁状联合缺如。鉴定为：小豹斑鹅膏(amanita parvipantherina)^[3-4]。

图 1 小豹斑鹅膏和假褐云斑鹅膏的子实体照片(a-c：小豹斑鹅膏,d-f：假褐云斑鹅膏) Figure 1 Basidioma of amanita parvipantherina and a. pseudoporphyria. (a-c: a.parvipantherina; c-d: a. pseudoporphyria)

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第二种蘑菇(图 1d-f)经形态学鉴定鉴定为假褐云斑鹅膏(amanita pseudoporphyria)。宏观结构：子实体中型至大型，菌盖扁平至平展；菌盖表面淡灰色、灰色至灰褐色，中部色较深，具深色纤丝状隐生花纹或斑纹，光滑或有时被白色至污白色破布状菌幕残余；菌盖边缘有时悬垂有白色菌环残余，无沟纹；菌褶白色，短菌褶近菌柄端渐窄，偶近平截。菌柄近圆柱形或向上稍细，白色或被白色纤毛状鳞片；基部棒状、腹鼓状至梭形，菌托浅杯状，游离檐托高达5 cm；菌环顶生至近顶生，白色，膜质，宿存或破碎消失。显微结构：担子棒状，具4个小梗，基部无锁状联合；担孢子宽椭圆形至椭圆形，无色，光滑，在Melzer’s试剂中呈淀粉质反应，(7～9) μm×(5～6.5) μm；菌柄基部的檐托内部主要由不规则排列的菌丝组成，期间夹杂有(较)丰富的膨大细胞。锁状联合缺如。鉴定为假褐云斑鹅膏^[3-4]。

提取蘑菇样品DNA，采用PCR技术对ITS片断进行扩增并测序，之后进行系统发育学分析。分子生物学鉴定：使用The Phire Plant Direct PCR 试剂盒(Finnzymes Oy,Finland)对样品进行PCR扩增。将干燥的蘑菇磨成粉后用50 μL稀释缓冲液裂解，室温孵育5 min，30 μL PCR反应体系中加入1 μL的上清液作为扩增模板。扩增目的片段为ITS，扩增引物为ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G)和ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) ^[5]。扩增程序：98℃预变性5 min；98℃变性5 s，58℃复性5 s，72℃延伸5 s，40个循环后72℃延伸10 min，4℃保温。取1 μL PCR产物加样进行电泳，后在凝胶成像仪下拍照记录结果。将电泳条带显示单一明亮、片段大小约650 bp的扩增样品进行测序。由于小豹斑鹅膏ITS序列扩增失败，因此本研究中仅对假褐云斑鹅膏进行了后续的系统发育研究。

系统发育分析使用PAUP version 4.0b10 ^[6],系统发育树中其他序列的选取主要参考文献^[7]。应用ITS片段构建假褐云斑鹅膏(amanita pseudoporphyria)的系统发育树：共13个单元，所有629个特征位点包括250个恒定特征，121个无简约信息可变特征，以及258个简约信息特征。简约法共得到1个MP树，系统发育树的TL为779，CI为0.783，RI为0.771，RC为0.604，HI为0.217。具体系统发育树拓扑结构图见图 2。

图 2 基于ITS序列构建的假褐云斑鹅膏系统发育树，仅高于50%的支持率被标注于分枝上(黑体的为事件标本序列) Figure 2 Phylogenetic tree of amanita pseudoporphyria inferred from maximum parsimony (MP) analysis based on ITS dataset. Only maximum parsimony bootstraps (PB) over 50% are reported on the branches. (Sequence from poisoning case specimen was in bold)

图选项

系统发育结果表明检测样本150803-08与假褐云斑鹅膏聚类到同一分枝，获得极高支持率(图 2,MP=100%),鉴定该标本为假褐云斑鹅膏。

我国的有毒蘑菇种类繁多，目前包括怀疑有毒的种类达四百三十余种，已知的蘑菇毒素有30多种^[1,9]。然而，由于很多中毒事件蘑菇种类没有经过专业人员进行物种鉴定，就简单的标记为毒蘑菇中毒，因此，目前毒蘑菇中毒事件中的毒蘑菇以标记为未知种类为主(77.09％)，而在已知种类的毒蘑菇中毒事件中大多也只能鉴定至科级，报道中毒蘑菇以鹅膏科和牛肝菌科种类为主^[8]。有毒蘑菇毒素种类多且成分复杂，一种有毒蘑菇可含多种毒素,一种毒素也可能存在于多种有毒蘑菇中，造成了中毒类型的复杂性，也给中毒救治带来了困难和挑战。

本次事件中，根据患者辨认食用的蘑菇样品，通过对蘑菇标本的形态学特征和分子鉴定，确定为假褐云斑鹅膏和小豹斑鹅膏。假褐云斑鹅膏菇含微量的鹅膏毒肽和烯丙基甘氨酸，中毒后潜伏期短，食后10 min 至 6 h内发病，主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症，很少有急性肝、肾功能衰竭和死亡。一般病程短，恢复较快，预后较好，致死率低,在蘑菇中毒案例中比较常见^[10]。小豹斑鹅膏毒性主要以神经精神型毒性为主^[11]。本次事件的流行病学特点、临床表现及毒菌标本的形态学特征和分子鉴定与有毒鹅膏物种引起的中毒症状吻合，因此此次中毒为误食2种不同健康效应的毒鹅膏菌中毒。本次事件中患者食用假褐云斑鹅膏和小豹斑鹅膏发生急性中毒导致严重神经精神型中毒症状，其中儿童患者病情较重可能与儿童体质量较轻有关。假褐云斑鹅膏菇和小豹斑鹅膏混合同时食用引起神经精神型中毒症状的机理还需要更深入的研究。