2016, Vol. 25
D-二聚体(D- dimer)是纤维蛋白单体经活化因子ⅩⅢ交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。多种疾病如急性肺栓塞、深静脉血栓、弥漫性血管内凝血、恶性肿瘤、急性冠脉综合征等均可出现D-二聚体升高[1-4]。随着D-二聚体检测在临床应用的逐渐深入，检测方法的多样化对不同方法间结果的可比性以及连续动态监测过程中结果的稳定性提出了更高要求。老年人群，尤其是危重症老年患者，深静脉血栓、肺栓塞、急性心脑血管疾病的发病率均高，能够快速、准确完成D-二聚体检测，对于疾病的鉴别及病情的判断有重要意义[5-7]。多项研究表明D-二聚体水平随年龄而增高[8-10]，因此对于老年患者快速得到准确的D-二聚体测定值，对检测设备的性能更需要进一步验证。
AQT90 FLEX免疫分析仪是一个集成化的床旁检测系统，它使用时间分辨荧光免疫分析方法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRF)定量检测全血样品中的D-二聚体含量，具有快捷、方便的特点，可在很大程度上缩短检测周期，降低医疗成本[11]。但床旁检测也具有检测环境不确定、非专业人员操作、缺少质量控制等特点，因此，对设备的性能评价尤为必要。ACL TOP全自动凝血仪采用免疫比浊法快速定量检测D-二聚体，结果可靠，一般为大型中心实验室所采用。
本研究参照我国卫生行业标准《D-二聚体定量检测》(WS/T 477-2015)[12]，以ACL TOP全自动凝血仪检测系统为参考，对AQT90 FLEX免疫分析仪D-二聚体检测系统的主要性能进行评价。
1 资料与方法 1.1 仪器AQT90 FLEX免疫分析仪是丹麦Radiometer公司产品，ACL TOP全自动凝血仪是美国Instrumentation Laboratory公司产品。
1.2 试剂AQT90 FLEX免疫分析仪配套试剂包(REAGENT PACK，批号为ST-16)、配套测试卡(D-二聚体 Test cartridge，批号为10880及10900)、配套定标卡(D-二聚体 Factory-defined Calibration Data，批号为10880及10900)及配套三个水平质控物(Level 1批号为16911；Level 2批号为16912；Level 3批号为16913)由丹麦Radiometer公司提供。
ACL TOP全自动凝血仪 D-二聚体检测试剂包(批号为B24702)及配套两水平质控物(批号为B24123)由西班牙沃芬集团提供。
1.3 标本采集2015年北京大学第一医院老年科住院患者年龄(89.23±8.34)岁(61~102岁)。血样共193份(男性158份，女性35份)，根据年龄分为<80岁组42份，≥80岁组151份。同时采集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，混匀后全血标本用于AQT90 FLEX免疫分析仪检测D-二聚体；采集枸橼酸钠109 mmol/L抗凝血，抗凝剂和血液比例为1∶ 9，混匀后，2000 g/min，10 min离心，分离血浆，3h内用ACL TOP全自动凝血仪完成D-二聚体检测。
1.4 方法 1.4.1 检测方法AQT90 FLEX免疫分析仪和ACL TOP全自动凝血仪质控在控后，进行标本测定，D-二聚体的报告单位为mg/L DDU。
1.4.2 评价内容(1) 批内不精密度 根据ACL TOP全自动凝血仪的检测结果，随机选取新鲜的全血标本高值和低值样本各一份，使用AQT90 FLEX免疫分析仪分别连续测定15次，计算高值样本和低值样本的算术均数(x ±s)、标准差(S)和变异系数(CV)。
(2) 携带污染率 取低值样本和高值样本各1份，分别测试三次，将测定结果记为L1、L2、L3和H1、H2、H3 ，则携带污染率为[(L1-L3)/(H3-L3)]×100%。
(3) 不同时间点重复测量结果分析 随机选取10份样品于采集样本后0 min、30 min、60 min、90 min用AQT90 FLEX免疫分析仪检测样本，运用方差分析比较不同时间点检测结果有无统计学意义。
(4) AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测结果相关性分析。
a 同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测D-二聚体浓度，使用相关系数评价两种系统检测结果的相关性。
b 按年龄分组，使用相关系数评价不同年龄组(<80岁组和≥80岁组)AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪两种系统检测D-二聚体浓度结果的相关性。
c 按性别分组，使用相关系数评价不同性别AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪两种系统检测D-二聚体浓度结果的相关性。
(5) 同型号(AQT90 FLEX免疫分析仪) 不同机器检测结果相关性分析 随机选取36份样本，同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪两台机器先后检测同一样本，使用配对t检验评价两台机器检验结果的一致性。
(6) AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测结果一致性及AQT90 FLEX免疫分析仪检测效能评价 将两种系统检测结果分别按照其诊断血栓的cut-off值(ACL TOP全自动凝血仪 D-二聚体试剂为0.24 mg/L DDU，AQT90 FLEX免疫分析仪为0.583 mg/L DDU)分为阴性和阳性，使用一致性检验评价两种系统对血栓诊断的一致性。以ACL TOP的检测结果作为参考，按照如下公式计算AQT90检验结果的总符合率、阳性符合率、阴性符合率及不符合率。总符合率=两种检测系统结果一致的人数/检测总人数×100%；阳性符合率= 两种检测系统结果均为阳性人数/ACL TOP全自动凝血仪检测为阳性人数×100%；阴性符合率= 两种检测系统结果均为阴性人数/ACL TOP全自动凝血仪检测为阴性人数×100%；不符合率=两种检测系统结果不一致的人数/检测总人数×100%。
1.5 统计学方法使用SAS 9.2软件完成相关统计分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，使用GraphPad Prism 5.0软件绘图。
2 结果 2.1 批内不精密度结果显示，在高低浓度水平，AQT90 FLEX免疫分析仪检测的稳定性可接受[5]。见表 1。
| 样品 | 平均值(mg/L) | 批内不精密度标准差(mg/L) | CV(%) |
| 高值样品 | 8.616 | 0.226 | 2.619 |
| 低值样品 | 0.347 | 0.010 | 2.767 |
L1、L2、L3、H1、H2、H3分别为0.35 mg/L、0.33 mg/L、0.34 mg/L 、8.39 mg/L、8.79 mg/L、8.81 mg/L，携带污染率为0.12%。
2.3 不同时间点重复测量结果分析D-二聚体在全血和血浆中的半衰期较短，约为8 h，如从采集样品至检测的时间间隔过长，可能会影响检测结果的准确性。比较取样后0 min、30 min、60 min、90 min四个时间点的检测结果，运用方差分析，差异无统计学意义(F=0.000 6，P=1.000)。
2.4 AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测结果相关性分析同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测193份样品，检测结果的相关系数r=0.949 1(P＜0.01)(见图 1)。
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| 图 1 AQT90与ACL检测结果相关性散点图 Figure 1 The scatter plot of relationship of AQT90 and ACL |
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同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测样品，在<80岁组相关系数为0.9881(P＜0.0001)(见图 2)、在≥80岁组相关系数为0.9443(P＜0.01)(见图 3)。
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| 图 2 AQT90与ACL检测结果相关性散点图(＜80岁组) Figure 2 The scatter plot of relationship of AQT90 and ACL(＜80 years old) |
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| 图 3 AQT90与ACL检测结果相关性散点图(≥80岁组) Figure 3 The scatter plot of relationship of AQT90 and ACL(≥80 years old) |
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不同性别组，同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测样品，结果示男性组相关系数r为0.9480(P＜0.01)(见图 4)、女性组相关系数r为0.9460(P＜0.01)(见图 5)。
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| 图 4 AQT90与ACL检测结果相关性散点图(男性组) Figure 4 The scatter plot of relationship of AQT90 and ACL(Male) |
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| 图 5 AQT90与ACL检测结果相关性散点图(女性组) Figure 5 The scatter plot of relationship of AQT90 and ACL(Female) |
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同时使用AQT90 FLEX免疫分析仪两台机器先后检测同一样本，用配对t检验比较，两组检验结果差异无统计学意义(t=0.051 1，P=0.959 4)。
2.6 AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测结果一致性及AQT90 FLEX免疫分析仪检测效能评价两种检测系统按其诊断血栓的cut-off值分为阴性和阳性检测结果见表 2，检测结果一致性的kappa系数为0.966 9，(95%置信区间为0.902 1，1)。AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪检测D-二聚体的总符合率为99.48%，其中阴性符合率为94.12%，阳性符合率为100%，不符合率为0.52%。
| AQT90 | ACL TOP | 合计 | |
| 阳性 | 阴性 | ||
| 阳性 | 176 | 1 | 177 |
| 阴性 | 0 | 16 | 16 |
| 合计 | 176 | 17 | 193 |
目前D-二聚体检测方法有乳胶凝集法、胶体金免疫渗透法、ELISA法等多种方法，检测标本类型可以是全血，也可以是血清和血浆，各种检测方法各有利弊[1][1, 13-14]。ACL TOP全自动凝血仪使用免疫比浊法测定血浆中的D-二聚体。它是利用抗原与抗体之间特异性结合的特点，使待测物与标记有特异性抗体的微粒结合，使得反应体系的浊度发生变化，通过检测其散射光强度的变化定量待测物的方法。该方法操作简便快速，结果可靠，应用十分普遍，但一般需在中心实验室的大型设备上进行，所以存在送检、批量测定及等待结果的时间成本，可能延误对病情的诊治。AQT90 FLEX免疫分析仪检测原理是时间分辨荧光免疫分析法。所用的检测标本为全血，其原理是将特定试剂包被于检测杯中，将生物素化的单克隆抗D-二聚体抗体预先固定在检测杯表面，再在捕获抗体上加一个隔离层和示踪抗体。检测过程中，样本和检测液被自动加入到含有特定试剂的检测杯中，经15 min孵化后，示踪抗体和捕获抗体与样本中的D-二聚体形成一个复合物，之后使用时间分辨荧光免疫分析法直接从检测杯的干燥表面测量用铕标记的示踪抗体的信号强度，运用校准曲线将实测值转化为D-二聚体的浓度[6, 15]。
与ACL TOP全自动凝血仪比较，AQT90 FLEX免疫分析仪无需样本离心，直接对全血检测，从第一个样品上样到得出第一个检测结果仅需20 min，随后每4 min检测出一个结果，具有检测速度快、便携、操作简单等特点，尤其适用于门急诊及重症监护病房的临床工作。但其检测样品是使用全血，检测结果有可能会受红细胞比容影响，且需使用EDTA抗凝，可能会影响D-二聚体聚集。因此，对AQT90 FLEX免疫分析仪性能的评价非常重要。
本研究评价了AQT90 FLEX免疫分析仪检测D-二聚体的批内不精密度、携带污染率、不同时间点检测结果的变化趋势，并比较了它与ACL TOP全自动血凝分析仪检测结果的相关性，结果显示批内不精密度低于厂家提供数值，仪器稳定性良好。携带污染率为0.12%，在可接受范围内。样品采集后不同时间点的检测结果差异无统计学意义，表明在所选时间范围内，D-二聚体随时间衰减对检测结果的影响可忽略不计。以ACL TOP全自动凝血仪为参考仪器，AQT90 FLEX免疫分析仪的检测结果与其比较，总符合率达99.48%，193份样本中，仅1份不符，AQT90 FLEX免疫分析仪检测D-二聚体为阳性(0.601 mg/L DDU)，ACL TOP全自动凝血仪为阴性(0.14 mg/L DDU)，提示AQT90 FLEX免疫分析仪的阴性排查能力可能弱于ACL TOP全自动凝血仪，敏感性更高，对于急症患者更不易漏诊，但因样本数较少，此结论尚需验证。此外，从相关性研究中得出的结果可看出，AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪的检验结果存在很好的相关性，AQT90=2.52ACL TOP+0.15，这可能与检验样品种类不同、检验方法不同、检测的D-二聚体的片段不同有关。在女性、高龄患者，倍数关系略增加，但本研究中80岁以下患者及女性患者样本数较少，此结论需进一步验证。通过本研究得出AQT90 FLEX免疫分析仪与ACL TOP全自动凝血仪的检验结果间的数量关系，便于连续动态监测D-二聚体的变化。
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