2016, Vol. 25
近年来大量研究发现黄体酮(progesterone, PROG)对急性脑创伤(traumatic brain injury, TBI)、脑卒中等神经系统疾病有减轻脑水肿，抑制过度炎症反应，细胞凋亡，兴奋性神经毒性等多效神经保护作用[1-2]。但PROG多效神经保护作用机制尚不清楚。Nrf2/ARE信号系统是重要的细胞保护机制，是许多保护性转录分子的共同上游调节系统[3]。本研究旨在探讨Nrf2/ARE信号系统在PROG多效神经保护中作用，进一步阐明PROG多效神经保护作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂与仪器36只雄性C57小鼠，体质量(25±2) g，购自杭州师范大学实验动物中心；36只雄性Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)小鼠，体质量(28±2) g，购自南京青紫兰科技有限公司。黄体酮注射液(浙江仙琚制药股份有限公司)；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(Uscnk，型号：SEA079Mu)；小鼠IL-1β ELISA检测试剂盒(Uscnk，型号：SEA563Mu)；小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒(Uscnk，型号：SEA133Mu)；Flou-4：Gibco公司；流式细胞仪(Accuri C6型，BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 小鼠TBI模型制作与分组Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)小鼠和C57小鼠采用改良Feeney法[4]制成自由落体TBI模型，分别随机(随机数字法)分成3组，每小组12只小鼠：假手术组(开颅手术但不致伤)；外伤对照组(致伤后腹腔注射等量生理盐水)；外伤+黄体酮组(致伤后立即腹腔注射黄体酮32 mg/kg)。
1.2.2 PCR鉴定Nrf2-/-基因敲除小鼠基因型随机选取6只Nrf2-/-小鼠进行PCR检测，提取小鼠血液基因组DNA。以相应溶剂为对照(Blank)，取2 μL DNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察260 nm/280 nm、260 nm/230 nm吸光度比值及连续波长吸收峰，并计算DNA溶液浓度，判断DNA提取质量：260 nm/280 nm吸光度>1.9且 < 2.2。
PCR反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定：Nrf2+/+引物序列：上游5’ -TGGACGGGACTATTGAAGGCT-3’；下游5’ -GCCGCCTTTTCAGTAGATGGA-3’。Nrf2-/-引物序列：上游5’ -TGGACGGGACTATTGAAGGCT-3’；下游5’ -GCGGATTGACCGTAATGGGATA-3’。
PCR产物电泳：按PCR产物:缓冲液以5: 1混合，点样于1%琼脂糖胶，100 V恒压30 min。
1.2.3 干湿质量法测定脑组织含水量伤灶周边取大鼠脑组织，测量湿质量，放在60 ℃恒温箱内孵育48 h后测定干质量，计算含水量。脑组织含水量(%)=[(湿质量-干质量)/干质量]×100%。
1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡取伤灶边沿3 mm处脑组织，放在10%中性多聚甲醛内固定，石蜡包埋切片，进行TUNEL凋亡染色。阳性细胞选择：细胞核DAB显色，细胞核以苏木精显色为准。根据阳性细胞分布情况，各个组别每个组织块400倍镜下选择1~2个阳性视野，计数200个细胞中阳性细胞数作为凋亡指数。计算出细胞凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数÷肿瘤细胞总数)×100%。
1.2.5 ELISA法检测脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α含量取伤灶边沿取脑组织，按照10%比例作组织匀浆，3 000 r/min，5 min，取上清按照试剂盒步骤测定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。
1.2.6 流式细胞仪检测胞内钙离子含量取新鲜大脑皮质置冰上，剥除软脑膜、血管，用冷PBS液冲洗2遍；用眼科剪将其剪碎成匀浆状；加入0.125 %胰蛋白酶37℃培养箱内消化15 min，加入含10%胎牛血清DMEM培养液室温终止消化。用移液管轻轻吹打混匀，将细胞悬液用200目筛网过滤；1 500 r/mmin离心5 min，弃上清，收集沉淀，PBS液漂洗2遍；细胞计数，制备106~107个/mL细胞悬液；加入Flou-4 /Am (终浓度5 μmol/L)，37 ℃避光孵育45 min。离心去上清，PBS漂洗3次，再加(m/mmol/L)1m PBS 37 ℃平衡20 min。上机检测FL-1通道荧光强度。利用流式细胞仪测得Fluo-3与细胞内Ca2+结合的荧光强度F；加入钙离子载体A23187(1×10-5mmol/L)及1 mmol/L的CaCl2 (使细胞外钙饱和)，测得最大荧光强度Fmax；再加入荧光淬灭剂MnCl2 (2 mmol/L)，测得最小荧光强度Fmin。然后根据公式计算神经细胞内钙离子含量：[Ca2+]i=Kd [(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/ L)，Kd代表解离常数为450 nmol/L。
1.3 统计学方法采用SPSS 11.5，所得数据均以均数±标准差(x±s)表示, 多组均数比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 Nrf2-/-基因敲除小鼠基因型鉴定结果电泳结果由图 1所示，700的为Nrf2+/+小鼠，400的为Nrf2-/-小鼠，同时有700和400 bp的为Nrf2+/-小鼠，可知所有编号PCR产物都只有400，无700条带，即所有小鼠均为Nrf2-/-小鼠。
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| 图 1 Nrf2基因敲除小鼠基因型的鉴定电泳图 |
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在C57小鼠脑损伤模型中，与假手术组比较，外伤对照组伤后1 d和3 d脑组织含水量显著增加(P < 0.05)；与外伤对照组比，外伤+黄体酮组Nrf2-/-小鼠在致伤后1 d和3 d脑组织含水量明显降低(P < 0.05)。在Nrf2-/-小鼠模型中，与假手术组比较，外伤对照组伤后1 d和3 d脑组织含水量显著增加(P < 0.05)；与外伤对照组比，外伤+黄体酮组伤后1 d和3 d脑组织含水量降低，差异无统计学意义(P > 0.05)(表 1)。
| 组别 | C57小鼠 | Nrf2-/-小鼠 | |||
| 伤后1 d | 伤后3 d | 伤后1 d | 伤后3 d | ||
| 假手术组 | 73.25±1.95 | 74.25±1.71 | 74.85±3.22 | 76.80±1.89 | |
| 外伤对照组 | 80.89±0.91a | 79.55±0.40a | 84.13±1.68a | 86.74±0.54a | |
| 外伤+黄体酮组 | 77.99±2.25b | 76.13±0.64b | 79.82±1.80 | 78.75±2.09 | |
| 注：与同时间点假手术组比较，aP < 0.05；与外伤对照组比较，bP < 0.05 | |||||
在C57小鼠脑损伤模型中，与假手术组比较，外伤对照组于伤后1 d和3 d，AI明显增加(P < 0.01)；外伤+黄体酮组AI明显增加(P < 0.05)。与外伤对照组比，外伤+黄体酮组AI明显下降(P < 0.05或P < 0.01)。在Nrf2-/-小鼠模型中，与假手术组比较，外伤对照组于伤后1和3 d，AI明显增加(P < 0.01)；外伤+黄体酮组AI明显增加(P < 0.05)。与外伤对照组比较，外伤+黄体酮组AI差异无统计学意义(P > 0.05)(图 2、3；表 2)。
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| 图 2 黄体酮对C57小鼠细胞凋亡的影响(TUNEL×400) |
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| 图 3 黄体酮对Nrf2-/-小鼠细胞凋亡的影响(TUNEL×400) |
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| 组别 | C57小鼠 | Nrf2-/-小鼠 | |||
| 伤后1 d | 伤后3 d | 伤后1 d | 伤后3 d | ||
| 假手术组 | 2.67±1.15 | 4.33±2.08 | 1.25±0.50 | 1.50±0.58 | |
| 外伤对照组 | 29.33±3.06b | 29.80±3.90b | 32.50±5.69b | 27.50±10.61b | |
| 外伤+黄体酮组 | 20.25±5.80ac | 15.40±5.77ad | 29.67±3.51a | 20.75±3.77a | |
| 注：与同时间点假手术组比较，aP < 0.05，bP < 0.001；与外伤对照组比较，cP < 0.05，dP < 0.01 | |||||
在C57小鼠脑损伤模型中，与假手术组比较，外伤对照组小鼠脑皮层IL-1β、IL-6和TNF-α表达均在伤后1 d和3 d均显著升高(P < 0.05或P < 0.01)；与外伤对照组，外伤+黄体酮组小鼠脑皮层IL-1β和TNF-α表达在伤后1 d和3 d明显降低(P < 0.05)；IL-6水平在伤后1 d差异无统计学意义(P > 0.05)，但在伤后3 d明显下降(P < 0.05)。在Nrf2-/-小鼠模型中，与假手术组比较，外伤对照组小鼠脑皮层IL-1β、IL-6和TNF-α表达均在伤后1 d和3 d均显著升高(P < 0.05)；与外伤对照组，外伤+黄体酮组小鼠脑皮层IL-1β、IL-6和TNF-α表达在脑损伤后1 d和3 d降低，但差异无统计学意义(P > 0.05)。(图 4)
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| 与同时间点假手术组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与外伤对照组比较，cP < 0.05 图 4 两种小鼠模型三组细胞因子水平比较(pg/mL) |
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在C57小鼠脑损伤模型中，与假手术组比较，小鼠脑组织钙离子含量在伤后1 d和3 d均显著升高(P < 0.01)。与外伤对照组比，外伤+黄体酮组脑组织钙离子含量在伤后1 d和3 d均有明显降低(P < 0.01)。在Nrf2-/-小鼠模型中，与假手术组比较，外伤对照组和外伤+黄体酮组脑组织钙离子含量在伤后1 d和3 d均显著升高(P < 0.05)。与外伤对照组比较，外伤+黄体酮组脑组织钙离子含量在伤后1 d和3 d均变化不大，差异无统计学意义(P > 0.05)(表 3)。
| 组别 | C57小鼠 | Nrf2-/-小鼠 | |||
| 伤后1 d | 伤后3 d | 伤后1 d | 伤后3 d | ||
| 假手术组 | 23.61±1.68 | 56.36±8.52 | 78.87±3.19 | 90.72±9.04 | |
| 外伤对照组 | 115.53±16.06b | 197.72±3.08b | 332.80±14.31a | 349.27±12.58a | |
| 外伤+黄体酮组 | 28.51±6.14c | 55.67±4.66c | 312.00±3.01a | 320.73±4.88a | |
| 注：与同时间点假手术组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与外伤对照组比较，cP < 0.01 | |||||
性激素在创伤性疾病中发挥重要的作用，影响创伤患者的预后[5]。近年来大量研究发现PROG对TBI神经保护是通过多效机制完成的：①通过Na+-K+ -ATPase抑制Na+内流，降低水通道蛋白-4(AQP-4)和细胞因子表达，减轻炎症和脂质过氧化，维持血脑屏障完整性等机制，减轻伤后脑水肿[6]。②通过影响凋亡相关基因的表达和线粒体渗透性转换，保护线粒体功能，抑制神经元凋亡[7]。③抑制谷氨酸兴奋性毒性[8]。④抑制TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB和补体C3等细胞因子[9]。⑤抑制脂质过氧化，减轻自由基损伤[10]。⑥神经营养和髓鞘修复作用[11]。
Nrf2/ARE信号系统是体内一个重要的细胞保护机制，广泛分布于机体的各个器官中[12]。Nrf2/ARE信号系统活化，促进一系列下游保护性基因的转录，可以保护细胞避免谷氨酸兴奋性毒性[13]、氧化损伤[13]、钙离子超载以及过度炎症反应所造成的细胞损害[14]。Nrf2/ARE信号系统在TBI病理过程中发挥重要的保护性作用。TBI后神经细胞内的Nrf2向细胞核内发生显著转移，同时脑组织内Nrf2/ARE通路下游标志性分子转录增加[15]。Nrf2敲除小鼠对脑损伤更加敏感，脑水肿、炎症反应和氧化损伤更严重[16]。因此，Nrf2/ARE系统是脑损伤后许多保护性转录分子的共同上游调节系统，激活Nrf2/ARE信号系统，通过其下游保护性分子，对脑损伤发挥多效神经保护作用。
目前尚不清楚黄体酮为何可以同时多靶点阻断TBI继发性损伤，其多效神经保护作用是如何实现的？本研究应用Nrf2基因敲除小鼠来观测黄体酮对TBI神经保护，实验结果表明，PROG在C57小鼠TBI模型中减轻脑损伤后脑水肿，抑制神经元凋亡，抑制炎症因子表达以及抑制钙离子过载等这些作用，在Nrf2-/-小鼠TBI模型中均未能体现出来。实验结果可以初步证明黄体酮对TBI多效神经保护作用需要Nrf2/ARE信号路径参与，黄体酮多效神经保护作用可能通过Nrf2/ARE信号系统来实现。但要完全证明这一假设，必需从整体、细胞和分子水平，应用基因敲除、RNA干扰、激动剂及阻断剂等干预手段，系统探讨黄体酮是否能激活Nrf2-ARE信号系统发挥神经保护作用，并分别从上游信号通路、转录因子-启动子及下游效应分子三个环节来验证这一假设，因而还需进一步的研究。
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