七氟烷预处理对心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤产生急性期和延迟性保护作用^[1]，延迟性保护相对于急性期保护更利于患者术后24~48 h心肌缺血的防护，但其具体作用机制尚不明确^[2]。最近研究表明缺血-再灌注后自噬小体大量蓄积，心肌梗死范围增加，通过敲除自噬相关基因减少自噬小体清除，并减少细胞死亡^[3]。本课题组先前报道吸入七氟烷可增加非损伤心肌自噬小体水平^{[1, 4]}，但七氟烷预处理是否通过影响自噬小体水平减少心肌缺血-再灌注损伤却鲜有报道。本研究拟通过评价再灌注后自噬小体水平与心肌损伤的关系，为明确七氟烷预处理产生心肌保护作用的机制提供参考。

成年雄性SD大鼠45只，体质量270~350 g，苏州大学动物实验中心提供。将大鼠放入特制吸入麻醉箱内进行预处理，大鼠随机(随机数字法)分为3组，每组各15只：假手术组(sham组)和缺血-再灌注组(CON组)吸入33%氧气2 h；七氟烷组(SWOP组)吸入混合33%氧气的1MAC(最低肺泡气有效浓度)七氟烷2 h。完成预处理24 h后腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，建立心肌缺血-再灌注模型。

麻醉大鼠后进行气管插管，并连接动物呼吸机(型号：ALC-V9，上海奥尔科特生物科技有限公司)行呼气末正压通气，吸入33%氧体积分数(氧流量为3 L/min)，调节呼吸频率或潮气量，维持pH 7.35～7.45、PaCO₂ 35～45 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)、PaO₂ 90～150 mmHg，分别于右颈内静脉、动脉置管并连接压力换能器。采用智能恒温控制仪(型号：JR-1，成都泰盟科技有限公司)维持大鼠体温在36～37 ℃。于左侧第5肋间开胸，打开心包，6-0无损伤缝合线在左心耳下缘穿过左冠状动脉前降支(LAD)，缝线末端穿入自制圈套管，平衡30 min。阻断LAD血供，当心外膜发绀苍白、心电图示一过性心律失常，ST段弓背向上抬高表示缺血模型成功。

再灌注2 h时处死大鼠取心脏，每组3只大鼠取1 mm³大小的心尖组织，采用光镜、透射电镜观察心肌细胞凋亡指数及超微结构。经固定、冲洗、脱水、包埋、切片、染色等处理后，即可通过光镜、透射电镜观察。依据TUNEL法显色，光镜下可观察到细胞核棕黄色着色的凋亡细胞。随机拍摄5个400倍(10×40) 视野，正常细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞为棕黄色，凋亡阳性细胞与视野中所有细胞的比值为平均阳性细胞率，并以百分数表示作为凋亡指数来反映凋亡程度。

采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死范围。于再灌注2 h时每组12只大鼠再次阻断LAD，颈内静脉注射5%伊文思蓝使心脏正常区域蓝染，分离左心室并用心脏切割器横断分割成5～6块2 mm厚的切片，分离蓝染的正常组织，将未染色的危险区组织置于0.5% TTC中，37 ℃水浴15 min，10%甲醛溶液固定过夜。梗死区被染为灰白色，显微镜下分割并称质量，心肌梗死范围以梗死区心肌重量占缺血区心肌重量的百分比表达。

于再灌注2 h时处死大鼠取心脏，将心肌组织加入细胞裂解液(江苏碧云天生物试剂公司)和蛋白酶抑制剂PMSF(江苏碧云天生物试剂公司)进行低温匀浆。BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo公司)测定蛋白样品含量，100 ℃持续加热5 min，选用8%～12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE)分离蛋白，转至硝酸纤维膜(Phamacia公司)，5%脱脂牛奶封闭2 h后，分别加入一抗LC3、p62、caspase-3(abcam公司，英国)、Cathepsin B(UPSTATE公司，美国)孵育过夜，TBS-T溶液漂洗后加入兔源二抗(Cell Signaling公司，美国)36 ℃孵育2 h，TBS-T溶液漂洗，最后进行化学增强发光反应，扫描后运用凝胶图象Scion Image 4.03(National Institutes of Health，美国)分析目的带的净吸光度值，以目的条带与内参GAPDH吸光度间的比值反应蛋白的表达水平。

采用SPSS15.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，与同一组比较采用Dunnet-t检验，两组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

术前稳定期各实验组间HR、MAP和心率与收缩压的乘积(RPP)差异无统计学意义。与术前稳定期比较，冠状动脉结扎引起各组MAP和RPP明显降低(P＜0.05) (表 1)。

CON组和SWOP组之间左室缺血区重占左室重的百分比差异无统计学意义(P=0.39) 。与CON组(49±11) %比较，SWOP组(36±8) %的心肌梗死范围减少(P=0.027) 。

TUNEL染色结果与sham组(4±3) %比较，CON组(35±6) %和SWOP组(24±6) %心肌细胞凋亡指数增高(P=0.004和0.015) ；与CON组比较，SWOP心肌细胞凋亡指数降低(图 1，P=0.042) 。

与sham比较，aP＜0.05；与CON比较，bP＜0.05；n=3；A: sham组；B: CON组；C：SWOP组 图 1 七氟烷预处理后凋亡指数变化(TUNEL×400) Figure 1 The changes of apoptotic index of seveflurane preconditioning(TUNEL×400)

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电镜下sham组心肌细胞核膜完整，染色质结构正常，胞质中细胞器形态正常。CON组和SWOP组大鼠心肌细胞核染色质边集，线粒体肿胀，嵴稀且短，出现大量自噬小体，且空泡变性严重；SWOP组较CON组线粒体、内质网轻度肿胀，自噬小体量少(图 2)。

Nu：细胞核；粗箭头：自噬溶酶体；细箭头：自噬小体；A: sham组；B: CON组；C：SWOP组 图 2 七氟烷预处理后自噬小体变化 Figure 2 The changes of autophagosomes of seveflurane preconditioning

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与sham组比较，CON组的LC3-Ⅱ(P=0.009) 、Cathepsin B(P=0.032) 、p62(P=0.007) 和caspase-3(P=0.006) 水平明显升高；与CON组比较，SWOP组的LC3-Ⅱ(P=0.033) 、p62(P=0.041) 和cleaved caspase-3(P=0.037) 水平降低，Cathepsin B(P=0.046) 水平升高。(图 3~6)。

与sham组比较，aP＜0.05；与CON组比较，bP＜0.05；n=5 图 3 大鼠缺血-再灌注2 h后七氟烷预处理对自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达改变 Figure 3 The protein expression of LC3-II after seveflurane preconditioning followed by 2 h reperfusion

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与sham组比较，aP＜0.05；与CON组比较，bP＜0.05，n=5 图 4 大鼠缺血-再灌注2 h后七氟烷预处理对自噬标志蛋白p62表达改变 Figure 4 The protein expression of p62 after seveflurane preconditioning followed by 2 h reperfusion

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与sham组比较，aP＜0.05；与CON组比较，bP＜0.05，n=5 图 5 大鼠缺血-再灌注2 h后七氟烷预处理对自噬标志蛋白Cathepsin B表达改变 Figure 5 The protein expression of Cathepsin B after seveflurane preconditioning followed by 2 h reperfusion

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与sham组比较，aP＜0.05；与CON组比较，bP＜0.05，n=5 图 6 大鼠缺血-再灌注2 h后七氟烷预处理对凋亡标志蛋白cleaved caspase-3表达改变 Figure 6 The protein expression of cleaved caspase-3 after seveflurane preconditioning followed by 2 h reperfusion

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本研究中于七氟烷预处理1 h、2 h时分别进行尾动脉采血，血气分析结果显示PaCO₂、PaO₂均处于正常范围内，排除大鼠吸入七氟烷过程可能出现的呼吸抑制，提示七氟烷预处理对大鼠呼吸循环系统是正常、稳定的。参照文献^[1-5]的方法，采用结扎左心室冠状动脉前降支缺血30 min，恢复灌注2 h制备在体大鼠心肌I/R损伤模型，结果表明，与sham组比较，再灌注2 h时CON组心肌梗死范围明显增加，提示动物模型制备成功^[6]。

自噬是真核细胞中代谢调节的主要机制，在饥饿、缺氧、缺血-再灌注等情况下可诱导自噬发生，缺血-再灌注后自噬小体大量产生^[3]。通常情况下，自噬通过单层或双层膜包裹衰老和受损细胞器形成自噬小体，然后运送到溶酶体形成自噬/溶酶体并进行多种酶的消化及降解，实现真核生物维持细胞稳态和更新的过程；但自噬小体过度产生，若未能及时与溶酶体溶合降解，可因自噬小体聚集，破坏细胞器功能，加速细胞凋亡和坏死^[7]。对于自噬小体的检测主要以透射电镜下超微结构的形态学检测为其金指标。但自噬是一个动态连续的概念，涵盖了自噬小体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程^[8]。显然，对这整个过程进行监测较单纯自噬小体检测更能反映自噬活性。微管相关蛋白1轻链3(LC3) 因能始终靶向定位于自噬体膜上直到与溶酶体溶合，是目前确认的唯一可信的自噬体标志物，LC3-Ⅱ的水平在某种程度上反映了自噬小体的数量^[9]。Cathepsin B是溶酶体的重要标记物，它的含量反映了自噬溶酶体溶合的强弱。而p62是运输自噬小体消化降解的底物蛋白，p62含量间接反映自噬小体清除水平。p62含量多伴随LC3-Ⅱ水平增加，提示自噬小体蓄积；反之，p62含量少伴随LC3-Ⅱ水平减少，提示自噬小体减少^[10]。本实验通过对自噬小体的形态学观察，发现SWOP组较CON组心肌自噬小体明显减少。Western blot结果显示，再灌注后心肌较sham组LC3-Ⅱ、p62水平增高，提示再灌注心肌自噬小体大量蓄积；SWOP组较CON组的LC3-Ⅱ水平和p62含量减少，提示七氟烷预处理可能加速自噬小体降解；SWOP组Cathepsin B水平升高也间接反映七氟烷预处理心肌自噬溶酶体溶合过程增强，增强自噬小体清除。当前研究符合之前报道，七氟烷后处理通过减少缺血后心肌LC3-Ⅱ、p62水平，增加Cathepsin B表达，减少心肌梗死范围；而应用自噬流抑制剂氯喹取消七氟烷对缺血心肌LC3-Ⅱ、p62水平抑制，Cathepsin B表达，消除了七氟烷的心肌保护作用^[11-12]。

SWOP是有别于急性期和后处理的心肌保护措施，心脏手术患者术后24~48 h是心肌缺血的高风险期，SWOP可以为围手术期患者提供充足的治疗时间窗^[2]。当前研究，SWOP组cleaved caspase-3水平、凋亡指数、心肌梗死范围较CON组明显减小，提示七氟烷预处理可减少细胞凋亡和梗死范围。可能的解释是七氟烷预处理增强缺血-再灌注后心肌自噬小体清除，促使自噬/溶酶体过程完成，以此减轻氧化应激损伤和自噬小体蓄积，减少细胞凋亡和梗死范围。Yan等^[11]和赵建祥等^[13]认为自噬溶酶体活性增强可以抑制心肌凋亡细胞出现。这种现象出现很大程度上取决于抗凋亡蛋白Bcl-2与Beclin 1之间的平衡关系，Pattingre等^[14]认为Bcl-2的表达上调不仅可以通过抑制Beclin 1减少自噬小体生成还可以抑制凋亡。本课题组以前报道过七氟烷预处理可上调Bcl-2表达^[15]，这也解释了吸入七氟烷不仅减少再灌注心肌自噬小体水平也减少了凋亡细胞的出现。

综上所述，七氟烷预处理对在体大鼠心肌缺血-再灌注产生延迟性保护作用可能与增强心肌自噬小体清除有关。