中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (3): 313-317
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魏冠, 林清江, 陈炳基, 孙文栋, 黄晓磊, 陈祥荣, 陈峻严. 丙戊酸抑制大鼠创伤性颅脑损伤后炎症反应[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(3): 313-317.
Wei Guan, Lin Qingjiang, Chen Bingji, Sun Wendong, Huang Xiaolei, Chen Xiangrong, Chen Junyan. Effect of valproic acid on inflammatory response after traumatic brain injury in rats[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(3): 313-317.
丙戊酸抑制大鼠创伤性颅脑损伤后炎症反应
魏冠, 林清江, 陈炳基, 孙文栋, 黄晓磊, 陈祥荣, 陈峻严     
362000 福建省泉州，福建医科大学附属第二医院急诊科(魏冠、林清江、陈炳基、孙文栋、黄晓磊)，神经外科(陈祥荣、陈峻严)
收稿日期: 2016-07-11
基金项目: 福建省自然科学基金项目(2016J01517)
*通信作者: 陈峻严，Email：dr.cjy@139.com.
摘要: 目的 研究丙戊酸对大鼠创伤性颅脑损伤后脑水肿、神经功能及炎症反应的影响,以探讨丙戊酸对大鼠创伤性颅脑损伤的保护及机制。 方法 采用改良Feeney DM法建立大鼠脑外伤(TBI)模型,将54只雄性成年SD大鼠，体质量220~250 g ，随机(随机数字法)分为3组(n=18)：假手术组(Sham)，颅脑损伤(TBI)组，颅脑损伤+丙戊酸处理(TBI+VPA)组。其中TBI+VPA组大鼠腹腔注射丙戊酸(每次300 mg/kg，12 h/次)，分别于伤后1、3、7 d进行神经行为学评分(mNSS)，断颈处死，取骨窗边缘2 mm处挫伤脑皮质采用干湿质量法测损伤区脑水含量；免疫荧光测定脑组织中巨噬细胞侵润情况；Western blot检查脑组织炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达水平的变化。统计分析采用SPSS 13.0进行成组资料方差分析和χ2检验。 结果 与Sham组比较，其余2组脑水含量和神经功能损伤评分升高，脑组织巨噬细胞侵润，炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达上调(均P＜0.05)；与TBI组比较,TBI+VPA组大鼠创伤后脑水含量明显降低 ；神经功能评分也相应改善 ；TBI+VPA组挫裂伤脑组织中巨噬细胞阳性率低于TBI组 ，脑组织中炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达也明显降低(P＜0.05)。 结论 丙戊酸对大鼠创伤性颅脑损伤具有神经保护作用，其机制可能是通过抑制伤后脑组织中巨噬细胞侵润，降低炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达，减轻伤后继发的炎症反应。
关键词: 创伤性颅脑损伤     丙戊酸     脑水肿     炎症反应     巨噬细胞     神经保护    
Effect of valproic acid on inflammatory response after traumatic brain injury in rats
Wei Guan, Lin Qingjiang, Chen Bingji, Sun Wendong, Huang Xiaolei, Chen Xiangrong, Chen Junyan     
Department of Emergency Medicine(Wei G,Lin QJ,Chen BJ,Sun WD,Huang XL),Department of Neurosurgery(Chen XR,Chen JY), The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China
*Corresponding author: Chen Junyan,Email：dr.cjy@139.com
Abstract: Objective To investigate the effects and mechanisms of valproic acid on brain edema, neurobehavioral outcome and inflammatory response after traumatic brain injury (TBI) in rats. Methods TBI animal models were established using Feeney’ s method.Fifty-four SD male rats, weighting 220-250 g, were randomly divided into 3 groups(n=18): sham operation group (group sham), traumatic brain injury group (group TBI) and valproic acid treatment group (group TBI+VPA).Experimental rats were treated with valproic acid (300 mg/kg, twice daily) by intraperitoneal injection.Rat behavioral outcomes were measured by modified neurologic severity score (mNSS) tests at day 1, 3, and 7 after TBI. Brain water content was measured with wet-dry weight method.The blood cells infiltration into cerebral cortex were tested with immunohistochemistry staining against ED-1 for macrophage.Inflammatory cytokines (INF-γ, tumor necrosis factor-α, interleukin-6) were measured by Western blotting.The statistical analysis were performed by ANOVA and chi-square tests using the statistical software program SPSS 13.0. Results Compared with the Sham group, the levels of brain edema, mNSS and macrophage cell infiltration were significantly increased after TBI(all P=0.00).The expressions of inflammatory cytokines were also increased significantly (all P=0.00 ).Compared with the TBI group, TBI+VAP group had significantly lower brain water content , and mNSS scores .VPA suppressed macrophage cell infiltration into cerebral cortex .Meanwhile, VPA inhibited the expressions of inflammatory cytokines (INF-γ, TNF-α, IL-6) (P＜0.05). Conclusions Treatment with VPA markedly reduced brain edema and improved neurological outcomes after TBI, possibly mediated by inhibited TBI-induced cerebral inflammatory responses and macrophage cell infiltrating into cerebral cortex.
Key words: Traumatic brain injury     Valproic acid     Brain edema     Inflammatory response     Macrophage     Neuro protection    

炎症反应在创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后继发的神经功能损伤中发挥重要作用。TBI发生后局部炎症反应可释放大量炎症因子，激活巨噬细胞，促使其由血管内侵入脑组织，进一步释放炎性介质，使炎症信号产生级联放大作用，破坏血脑屏障，加剧脑水肿，导致神经细胞变性坏死，影响神经功能恢复[1-2]。有效抑制伤后炎症反应，能改善TBI患者的预后。丙戊酸(valproic acid, VPA)作为广谱的抗癫痫药，广泛用于控制创伤后继发癫痫[3]。近年研究表明丙戊酸还具有神经保护作用，能明显改善脑梗死、脊髓损伤等多种神经系统疾病的神经功能[4-5]。但丙戊酸对TBI是否也有神经保护作用，特别是炎症反应是否参与此过程目前尚不清楚。本研究采用大鼠颅脑损伤模型，探讨丙戊酸对TBI后脑水肿、炎症反应及神经功能的影响，为其在TBI临床治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

干扰素γ(INF-γ)、白细胞介素6(IL-6) 、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(CST公司，美国)；巨噬细胞特异标志物ED-1(Abcam公司，英国)；丙戊酸(Sigma公司，美国)；Image Quant Las 4000 mini软件(GE公司，美国)；山羊抗兔IgG或山羊抗鼠抗兔IgG(1:3 000，CST公司，美国)

1.2 动物及分组

54只健康雄性成年SD大鼠，体质量220~250 g；大鼠按随机数字表法随机分为假手术组(Sham)，颅脑损伤(TBI)组，颅脑损伤+丙戊酸处理(TBI+VPA)组，每组18只，再按1、3、7 d三个时间点分设3个亚组，每亚组均为6只。所有实验内容经福建医科大学动物伦理委员会同意。

1.3 动物实验干预及模型制作

动物饲养在温度控制的环境(22±3) ℃下，12 h明暗循环，自由饮食和饮水。采用改良Feeney DM自由落体硬膜外撞击方法制作大鼠颅脑损伤模型[2, 6]：戊巴比妥钠腹腔麻醉(50 mg/kg)后，在侧冠状缝后2 mm、中线旁开2 mm处切开头皮，钻一直径5 mm骨孔，硬膜保持完整，用30 g重的击锤从20 cm处自由坠落冲击撞杆致大鼠中型颅脑损伤(致伤冲击力为600 g·cm)，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。假手术组仅开骨窗不打击。TBI+VPA组于造模后0.5 h，参照文献[3]选择VPA给药剂量，大鼠腹腔注射丙戊酸(每次300 mg/kg，12 h/次)，另外2组大鼠注射等剂量溶剂生理盐水。

1.4 神经功能损伤评分

神经功能测定采用改良神经功能评分(modified neurological severity scores，mNSS)进行评分。评估大鼠进行运动(肌肉状态、异常动作)、感觉(视觉、触觉、平衡觉)和反射功能检查[1]。当不能正确完成某项任务或所试的反射消失时得分。分值越高说明神经功能损伤越重。分别于造模后1、3、7 d进行神经功能测定。

1.5 脑水含量的测定

相应时间点大鼠在mNSS评分后，断颈取脑，取骨窗边缘约2 mm处新鲜脑皮质(200±20) mg，电子分析天平上称湿质量，用已知重量的编号锡纸包裹，后置入100 ℃烘箱烘烤24 h，再测干质量。脑组织含水量(%)＝[(湿质量-干质量)/湿质量]×100%。

1.6 免疫荧光染色检测脑组织ED-1(巨噬细胞特异标志物)的表达

取骨窗边缘2 mm处挫伤脑组织，标本甲醛固定、石蜡包埋，切片(厚约2 μm)后经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸缓冲液微波法修复抗原，羊血清封闭，滴入一抗ED-1抗体(兔属，1:400) ，阴性对照组用磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗，孵育过夜，PBS冲洗后，加1:100稀释的FITC标记的羊抗兔二抗，孵育30 min后，Hoechst 33342染核，封片。利用荧光显微镜观察实验结果。随机采集5个视野，计数阳性细胞所占比例，取平均值用于统计。

1.7 Western blotting检测挫伤灶脑组织ED-1、INF-γ、TNF-α、IL-6蛋白的表达

取骨窗边缘处2 mm处挫伤脑组织约100 mg，研磨成匀浆，加入裂解液裂解蛋白后收集，定量组织蛋白，煮沸离心蛋白，离心力为9 800 g，离心5 min，取上清液，-20 ℃保存备用。总上样蛋白量为20 μg，进行SDS-PAGE电泳，电压120 V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5 cm；然后将蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，于含100 g/L脱脂奶粉的封闭液中室温封闭2 h。ED-1(兔属，1:400) ，INF-γ(兔属，1:400) ，TNF-α(小鼠属，1:500) 、IL-6(小鼠属，1:500) 4 ℃过夜，加入相对应的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠抗兔IgG(1:3 000，CST公司，美国)室温孵育1 h，ECL发光试剂对硝酸纤维素膜进行显色反应，拍照。Image Quant Las 4000 mini软件(GE公司，美国)拍照，分析测定条带灰度值。以目的基因条带灰度值与GAPDH条带灰度的比值反映目的基因的表达水平。

1.8 统计学方法

结果采用SPSS 13.0统计软件包处理分析数据。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，组间两两采用SNK-q法；计数资料以绝对值表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 丙戊酸改善大鼠创伤性颅脑损伤后神经功能

伤后第1、3、7天，Sham组mNSS评分差异均无统计学意义(均P>0.05) ，评分多为0~2分；与Sham组比较，TBI和TBI+VPA组大鼠伤后第1、3、7天mNSS评分显著增高(P＜0.05) ，其中在伤后第1天mNSS评分最高；伤后3、7 d TBI+VPA组大鼠的mNSS评分低于TBI组，其中伤后第3天：(10.53 ±0.32) vs.(11.74 ±0.48) ，P=0.02；第7天：(7.97 ±0.32) vs.(10.30±0.42) ，P=0.01，见表 1。

表 1 3组大鼠创伤性颅脑损伤后不同时间mNSS评分的比较(x±s) Table 1 Comparison of modified neurologic severity scores in the three groups after traumatic brain injury (x±s)
组别例数mNSS评分
1 d3 d7 d
Sham组 61.29±0.34 1.16±0.301.09±0.19
TBI组612.58±0.73a 11.74±0.48a10.30±0.42a
TBI+VPA组6 11.98±0.51a 10.53±0.32ab 7.97±0.32ab
 注：与Sham组比较，aP＜0.05；与TBI组比较，bP＜0.05
表选项
2.2 丙戊酸减少大鼠颅脑创伤后脑水肿

与Sham组比较，TBI和TBI+VPA组伤后第1、3、7天脑组织水含量明显升高, 差异有统计学意义(P＜0.05) ，伤后3 d含水量最高。伤后3、7 d TBI+VPA组脑组织含水量低于TBI组，其中伤后第3天：(80.12 ±0.59) %vs.(82.14 ±0.67) %，P=0.04；第7天：(74.74 ±0.72) %vs.(77.93 ±0.48) %，P=0.01，见表 2。

表 2 实验组各时间点脑水含量比较(%，x±s) Table 2 Comparison of brain water content in the three groups after traumatic brain injury(%, x±s)
组别例数脑水含量(%)
1 d3 d7 d
Sham 组670.86±0.51 71.74±0.41 71.28±0.49
TBI 组6 79.39±0.56a82.14±0.67a 77.93±0.48a
TBI+VPA组 6 78.54±0.49a 80.12±0.59ab74.74±0.72ab
 注：与Sham组比较，aP＜0.05；与TBI组比较，bP＜0.05
表选项
2.3 丙戊酸抑制巨噬细胞的侵入

免疫荧光染色结果显示在伤后第3天，Sham组未见巨噬细胞(巨噬细胞特异标志物ED-1染色阳性)侵入；TBI组和TBI+VPA组大鼠脑组织内可见巨噬细胞侵入，巨噬细胞阳性率明显高于Sham组，差异有统计学意义(P＜0.05) ；TBI+VPA组巨噬细胞阳性率低于TBI组，见图 1。

A：3组ED-1阳性细胞代表图片(×200) ； B：ED-1阳性细胞所占的相对量(%)；与TBI组比较，aP＜0.05 图 1 免疫荧光染色检测3组大鼠脑组织ED-1的表达(×200) Figure 1 Macrophage stained by immunofluorescence in the 3 groups of rat brain tissues on the three day after brain injury(×200)
图选项
2.4 丙戊酸对损伤后脑组织ED-1、INF-γ、TNF-α、IL-6蛋白表达的影响

在伤后第3天，与Sham组比较，TBI组和TBI+VPA组大鼠挫伤灶脑组织ED-1、INF-γ、TNF-α、IL-6蛋白表达显著增高(P＜0.05) ；与TBI组比较，TBI+VPA组挫伤灶脑组织ED-1和炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P＜0.05) (图 2) 。

A：3组ED-1阳性细胞代表图片(×200) ； B：ED-1阳性细胞所占的相对量(%)；与Sham组比较，aP＜0.05；与TBI组比较，bP＜0.05 图 2 Western blotting检测3组大鼠挫伤灶脑组织ED-1和炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6蛋白的表达 Figure 2 Inflammatory cytokines (ED-1, INF-γ, TNF-α and IL-6) tested by Western blotting in the 3 groups of rat brain tissues on the three day after brain injury
图选项
3 讨论

丙戊酸(VPA)是广谱的抗癫痫药，临床上广泛用于控制各类型癫痫发作。丙戊酸可通过抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)谷氨酸受体；阻断或降低电压门控钠和钙离子通道，减少神经元的兴奋性[7-8]。近年研究表明丙戊酸作为组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂，可升高体内乙酰化的组蛋白，通过维持组蛋白乙酰化平衡来调控基因转录，在多种中枢神经系统疾病中起保护作用[9-10]。本研究组前期实验在改良Feeney DM法建立大鼠TBI模型基础上，发现伤后7 d内脑损伤明显，因此本研究选择模型后第1、3、7天进行指标测定。研究结果表明丙戊酸可减轻大鼠TBI后脑水肿，尤其在脑损伤3 d后脑含水量降低更为明显，神经功能评分也显著改善，这提示丙戊酸对伤后神经修复有保护作用。但丙戊酸对TBI后神经保护作用的机制，特别是伤后炎症反应是否参与此过程仍不明确。

炎症反应在继发性颅脑损伤病理过程中发挥重要的作用。金保哲等[11]研究发现丙戊酸钠能抑制创伤性颅脑损伤后大鼠局部炎性，下调炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。笔者之前研究[1]表明伤后局部脑组织炎症反应，释放大量炎症因子如INF-γ、TNF-α、IL-6，损伤血管内皮细胞，增加血脑屏障的通透性，进而加剧脑水肿和神经细胞损害[2, 12]。正常脑组织内未见巨噬细胞，但当颅脑损伤发生后，血脑屏障受到破坏，血液中的巨噬细胞在炎症因子的刺激下，由血管内侵入脑组织，进一步释放炎性介质，使炎症信号产生级联放大作用，加重继发性脑损害[12-13]。本研究发现大鼠颅脑损伤后第3天，挫裂伤脑组织中可见大量巨噬细胞侵润，炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6明显增多，与神经功能评分和脑水肿呈相关性，提示炎症反应在颅脑损伤后脑水肿和神经功能恢复中发挥重要作用。与颅脑损伤组比较，丙戊酸能抑制伤后脑组织中巨噬细胞侵润，降低炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达，明显降低伤后炎症反应，这提示了丙戊酸可通过抑制颅脑损伤后炎症反应起到神经保护作用。

总之，本研究证明丙戊酸能减轻大鼠创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度, 改善伤后神经功能行为，具有神经保护作用。其机制可能是通过抑制伤后脑组织中巨噬细胞侵润，降低炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-6表达，减轻伤后继发的炎症反应。

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