百草枯 (paroquat, PQ) 是一种高效能的非选择性接触型除草剂，对人畜具有很强毒性，误服或自服可引起急性中毒，尤其在我国，口服大量PQ是一种常见的自杀手段。PQ中毒后可引起皮肤、肺脏、肝脏、肾脏、心脏等全身多器官不同程度的损伤, 其中以肺脏毒性最为突出, 尤其是中毒晚期形成不可逆的肺纤维化，这是PQ中毒后导致呼吸衰竭死亡的重要原因^[1-2]。即使是PQ中毒经抢救后存活者也大多存在肺间质纤维化, 导致预后不佳。近年来多项研究表明Rho/ROCK信号途径活化后，通过调节细胞骨架的重组，为细胞迁移提供动力，参与多个组织脏器的纤维化过程^[3-4]。法舒地尔是Rho激酶特异性抑制剂，近年来研究发现法舒地尔通过抑制炎症损伤反应，减少纤维化相关的细胞增殖及迁移，减轻组织器官重构等，能够改善多种组织纤维化^[5]。本研究观察Rho/ROCK信号转导通路在百草枯致肺纤维化的作用，并予法舒地尔干预，以探讨法舒地尔对百草枯中毒肺纤维化的治疗作用。

质量浓度为20%的百草枯浓缩液购自南通先正达作物保护有限公司，法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司。羟脯氨酸试剂盒 (南京建成生物工程研究所)，RNA提取试剂盒Trizol Reagent (美国invitrogen公司)，逆转录试剂盒 (美国Thermo scientific公司)，PCR试剂盒 (天根生化科技有限公司)，蛋白提取试剂盒 (Thermo Pierce公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒 (上海碧云天生物技术研究所)。

72只健康SPF级SD雄性大鼠，200~230 g，10周龄左右，由杭州实验动物中心提供，动物合格证号SCXK (浙)2014-0001。将72只SD大鼠随机 (随机数字法) 分为4组, 即NS组、FS对照组、PQ染毒组及FS干预组。造模前，20%百草枯溶液用生理盐水稀释为质量浓度为1%百草枯溶液，PQ染毒组、FS干预组分别给予50 mg/kg百草枯溶液一次性灌胃染毒。FS对照组及FS干预组给予法舒地尔注射液30 mg/(kg·d) 腹腔注射1次干预，PQ染毒组及NS组给予等量生理盐水每天1次腹腔注射。每天观察并记录各组大鼠的精神状态及行为学改变。在第7、14、28天各组随机取6只大鼠，麻醉后开胸完整取出肺组织并观察整体肺的变化情况，切取左上肺置于4%甲醛中固定，制备石蜡切片供组织学检查、HE染色、Masson染色，其余肺组织入-80℃低温冰箱保存，待测时制备肺组织匀浆。

(1) 对4%多聚甲醛固定液中保存的肺组织，石蜡包埋后制成切片，分别HE染色，Masson染色。光镜下观察肺内显微结构变化。(2) 应用Ashcroft评分^[6]对大鼠肺组织纤维化进行判定，具体评定标准为：0级，肺组织正常；1级，细支气管或肺泡壁轻度纤维化；3级，细支气管或肺泡壁中度纤维化，但无明显肺组织结构破坏；5级，明显纤维化并伴有肺结构被破坏，形成纤维条带或纤维小结节；7级，为重度肺结构破坏或出现大片纤维化的区域；8级，为全部视野出现纤维性病灶。2、4、6级分别为以上1、3、5、7级的过渡区域。在光镜下对HE染色组织切片病灶纤维化程度半定量分析，每个样本随机选30个视野进行评分，由3名病理科医生进行盲评，最终评分取平均数。

取出左下肺组织，精确称质量0 mg，准确加水解液1 ml混匀，加盖后95℃或者沸水浴水解20 min，严格按HYP试剂盒说明书用样本碱水解法进行测定。

从肺组织中提取总RNA, 按逆转录试剂盒操作说明RNA逆转录为cDNA, 再依照PCR试剂盒进行PCR扩增。反应总体系25 μl，Real time PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s, 72 ℃延伸30 s, 进行40个循环；72 ℃充分延伸5 min。根据Ct值来计算相关基因的表达量。Ⅰ型胶原蛋白 (COL1a2)、Ⅲ型胶原蛋白 (COL3a1)、ROCK1、CTGF、18s基因均由上海基康生物有限公司合成，其引物序列见表 1。

按照总蛋白提取试剂盒说明书提取肺组织总蛋白，BCA法测蛋白浓度，制备上样缓冲液，配制8%~12%分离胶和5%浓缩胶，每个孔60 μg总蛋白进行上样，每孔10 μL，浓缩胶60 V，分离胶80 V进行电泳2 h左右。转膜，封闭60 min，4 ℃孵育过夜，一抗浓度 (见表 2)，洗膜，二抗室温孵育1 h, 二抗浓度1: 5 000，洗膜，ECL显影。由Quanty one软件进行灰度值分析，目的蛋白与内参蛋白灰度值比值即此目的蛋白的相对含量。

所有实验数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析，以均数±标准差 (x ±s) 表示。成组设计多样本选用one-way ANOVA方法检验，组间比较用LSD-t法。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

NS对照组和FS对照组大鼠活动自如，反应灵敏，皮毛光滑, 正常进食, 体质量呈增长趋势。PQ染毒组大鼠在染毒1 h后，出现活动增加，烦躁不安；6 h后，出现呼吸急促，活动减少，拱背倦卧，进食减少，皮毛蓬松黯淡，1~3 d上述症状最重，7 d后大鼠精神状态好转，活动增加。与同时间段PQ染毒组比较，FS干预组大鼠其呼吸急促、进食减少、反应迟钝、毛发蓬松黯淡等表现相对较轻。

NS组与FS对照组大鼠肺脏无明显异常，呈粉红色，无出血、坏死，质地软，富有弹性。PQ染毒组大鼠第7天双肺体积增大，呈暗红色，表面可见点状出血灶，弹性较差；第14天PQ染毒组大鼠双肺体积较前缩小，仍呈暗红色，表面可见较多点、斑片状陈旧性出血灶，硬度较前增加；第28天PQ染毒组大鼠双肺呈苍白色，体积明显缩小，表面凹凸不平，弹性差，硬度较前增加。FS干预组大鼠肺脏大体病理改变与PQ染毒组相似，但病变程度较同时间点PQ染毒组有所减轻。

第28天HE及Masson染色结果显示，NS组与FS对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔较薄，未见充血、出血、炎症细胞浸润和纤维组织沉积。PQ染毒组大鼠肺组织结构破坏严重，损伤范围较广，部分肺泡塌陷融合，肺泡间隔明显增厚，呈弥漫性肺纤维化，其间见炎性细胞浸润。FS干预组大鼠仍有肺泡炎及纤维化形成，但纤维化程度与PQ染毒组相比有明显减少，未见弥漫性肺纤维化，病变部位呈局灶性分布，肺泡间隔增厚不明显。见图 1~2。

图 1 第28天各组大鼠肺组织病理改变 (HE×400) Figure 1 Pathological changes in the lung tissue of rats on 28 HE×400

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图 2 第28天各组大鼠肺组织病理改变 (Masson×400) Figure 2 Pathological changes in the lung tissue of rats on 28 d (Masson×400)

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采用Ashcroft评分法对第28天各组大鼠肺组织纤维化进行评分发现，NS组与FS对照组比较，差异无统计学意义 (P>0.05)，PQ染毒组大鼠在第28天肺纤维化程度明显，与NS组比较差异具有统计学意义 (P < 0.05)，FS干预组与PQ染毒组比较，肺纤维化程度明显减轻，差异具有统计学意义 (P < 0.05)，见图 3。

与NS组比较，aP < 0.05；与PQ染毒组比较，bP < 0.05 图 3 第28天各组大鼠肺组织纤维化Ashcroft半定量评分 Figure 3 Ashcroft semiquantitative score in the lung tissue fibrosis of rats on 28d

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NS组和FS对照组HYP含量差异无统计学意义 (P>0.05)。与NS组比较，PQ染毒组和FS干预组HYP含量第7、14、28天均升高，且持续升高，第28天HYP含量最高，差异具有统计学意义 (P < 0.05)。与同一时间点PQ染毒组比较，FS干预组HYP含量显著降低，差异具有统计学意义 (P < 0.05)，见表 3。

NS对照组与FS对照组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1 mRNA的表达量均较低，两组比较差异无统计学意义 (P > 0.05)；与NS组比较，PQ染毒组和FS干预组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1 mRNA的表达量在7 d、14 d、28 d表达量显著增高，并呈逐渐升高趋势，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；与同一时间点PQ染毒组比较，FS干预组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义 (P < 0.05)。如表 4~7。

NS对照组与FS对照组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1蛋白的表达量均较低，两组比较差异无统计学意义 (P > 0.05)；与NS组比较，PQ染毒组和FS干预组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1蛋白的表达量在7 d、14 d、28 d表达量显著增高，并呈逐渐升高的趋势，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；与同一时间点PQ染毒组相比较，FS干预组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义 (P < 0.05) 大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、CTGF、ROCK1蛋白表达量与其相应mRNA的表达量趋势相一致。见图 4。

1：NS组；2：FS对照组；3：PQ染毒组；4：FS干预组 图 4 各组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1蛋白的表达 Figure 4 Expression of Collagen Ⅰ、Ⅲ、CTGF、ROCK1 protein in the lung tissue of rats at different time points

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PQ在肺里的浓度是血浆中的6~10倍^[7-8], 其主要毒性作用于肺，PQ进入肺组织后肺泡上皮细胞受到损伤，各种与纤维化相关的细胞因子组成的复杂而庞大的网络被激活，导致各种炎性细胞聚集，释放多种炎性介质，导致肺泡结构破坏，并启动多条细胞因子转导途径，造成成纤维细胞增殖，胶原蛋白沉积，启动和加重细胞凋亡，最终导致肺纤维化^[9-11]。因此，PQ中毒后多种细胞因子介导的信号通路的启动、激活在随后的肺纤维化过程中起着重要的作用。

CTGF具有明显的丝裂原性和趋化性，与细胞外基质 (ECM) 成分相互作用，刺激细胞黏附、增殖和迁移，促进细胞表型转化、ECM的合成，在纤维化疾病和肿瘤组织中高表达^[12]。CTGF在肺纤维化模型中表达明显增加，同时作为构成肺间质ECM主要成分的胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ在肺纤维化模型中表达也明显增加^[13]。苏艺伟等^[14]研究发现在PQ染毒后肺组织CTGF的表达量升高，通过慢病毒介导的shRNA干扰能够有效抑制PQ致肺纤维化模型中CTGF的表达，减轻PQ致肺纤维化的程度。本实验也发现PQ染毒后大鼠肺组织CTGF的表达量在第7天、14天、28天显著升高，并随着染毒时间的延长而呈现逐渐升高的趋势，而且CTGF表达量在各个时间点与PQ组肺HYP含量，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，肺病理胶原沉积情况一致，可见CTGF与PQ中毒致肺纤维化密切相关。

Rho激酶即Rho相关激酶ROCK, 是Rho下游靶效应分子, 小G蛋白Rho如“分子开关”一样激活下游靶分子Rho激酶, 触发下游激酶级联反应, 参与调节细胞的多种生物学行为, 包括细胞有丝分裂黏附, 细胞骨架调整, 肌肉细胞收缩, 细胞迁移、增殖、凋亡及基因表达^[3]。近年来国外学者发现，Rho/ROCK信号通路参与许多纤维化、硬化性病，是一类重要的细胞信号转导的中介分子，激活后的Rho/ROCK影响许多生物学行为，被称为肌动蛋白细胞骨架和细胞形态异质性的调节器^[15]。目前在体内外心肌、肝、肾、肺纤维化等疾病的研宄中，ROCK抑制剂与纤维化的发病机制及相关治疗已得到广泛关注。有研究发现Rho/ROCK信号转导通路可以使CTGF活化，而CTGF的过度表达和成肌纤维细胞的形成都依赖于RhoA信号转导。同时，胶原生成的抑制与Rho途径也有密切的关系^[16]。辛伐他汀通过Rho信号机制抑制IPF患者肺成纤维细胞的CTGF基因和蛋白表达。本研究发现正常对照组与法舒地尔对照组ROCK1 mRNA和蛋白表达量较低，百草枯染毒组ROCK1 mRNA和蛋白表达量较高，且ROCK1表达量与Ⅰ、Ⅲ型胶原、CTGF表达量趋势相一致，提示Rho/ROCK信号通路参与百草枯中毒肺纤维的形成过程，并发挥重要作用，阻断Rho下游通路可能是急性百草枯中毒肺纤维化治疗靶点之一。

Rock抑制剂法舒地尔可通过抑制炎症损伤反应，阻止上皮-间质转分化、减少纤维化相关的细胞增殖及迁移，减轻器官重构等，改善多种组织纤维化。法舒地尔能明显减轻输尿管梗阻导致的肾小球间质纤维化。漆秀洁等^[17]研究发现，法舒地尔通过作用于Rho/ROCK信号通路，一定程度改善高氧致新生大鼠肺纤维化。本研究中，法舒地尔干预组与百草枯染毒组比较，各个时间点，FS干预组HYP含量均降低，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、CTGF、ROCK1 mRNA和蛋白表达量显著降低，肺组织病理也较百草枯染毒组有所改善，因此可以得出结论，在急性百草枯中毒所致的大鼠肺纤维化模型中，法舒地尔通过作用于Rho/ROCK信号转导通路，抑制CTGF的活化，进而使Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量下降，HYP含量降低，对急性百草枯中毒所致肺纤维化有一定的治疗作用，因而本研究为临床应用法舒地尔治疗急性百草枯中毒所致肺纤维化提供了一定的理论和实验依据。