中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (4): 401-404
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康元元, 史佳, 余剑波, 傅强, 张圆, 宫丽荣, 董树安. CORM-2通过p38MAPK信号通路对脂多糖刺激大鼠肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(4): 401-404.
Kang Yuanyuan, Shi Jia, Yu Jianbo, Fu Qiang, Zhang Yuan, Gong Lirong, Dong Shuan. Effects of CORM-2 on mitochondrial fission protein Fis1 in the Lipopolysacchoride-activated lung macrophages of rats through p38MAPK signaling pathway[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(4): 401-404.
CORM-2通过p38MAPK信号通路对脂多糖刺激大鼠肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1的影响
康元元, 史佳, 余剑波, 傅强, 张圆, 宫丽荣, 董树安     
300100 天津，天津医科大学南开临床学院，天津市南开医院麻醉科 (康元元，史佳，余剑波，张圆，宫丽荣，董树安)；300100 天津，天津市第四中心医院重症监护室 (傅强)
收稿日期: 2016-11-20
基金项目: 国家自然科学基金 (81372096)；天津市卫生局科技基金 (2015KY26)；天津市卫计委基金项目 (2014KZ048)
通信作者: 余剑波，Email：jianboyu99@sina.com.
摘要: 目的 探讨CORM-2通过p38分裂原激活蛋白激酶 (p38MAPK) 信号通路对脂多糖 (LPS) 刺激大鼠肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1的影响。 方法 将传代培养的大鼠肺泡巨噬细胞以2×105/mL密度接种于96孔板。培养24 h后，采用随机数字表法将其分为4组：正常对照组 (C组)、LPS组 (L组)、CO释放剂CORM-2+LPS组 (LC组)、p38MAPK抑制剂SB203580+CORM-2+LPS组 (LCS组)。细胞孵育24 h时，应用试剂盒测定线粒体MDA含量及SOD活力，应用Western blot测定HO-1、线粒体相关分裂蛋白Fis1和p38的表达。应用RT-PCR测定HO-1和Fis1 mRNA含量的表达。 结果 与C组比较，L组MDA[2.43±0.12 vs. 3.59±0.07]含量、HO-1[1.31±0.27 vs. 1.65±0.41]、Fis1[1.27±0.23 vs. 1.65±0.41]、p38[1.01±0.24 vs. 1.36±0.17]表达水平升高，SOD[81.7±1.62 vs. 54.7±1.62]活力降低 (P < 0、05)；与L组比较，LC组MDA[3.59±0.07 vs. 3.08±0.52]含量、Fis1[2.01±0.35 vs. 1.48±0.39]表达水平降低，SOD[54.7±1.62 vs. 67.4±1.32]活力、HO-1[1.65±0.41 vs. 2.25±0.18]、p38[1.36±0.17 vs. 1.78±0.23]表达水平升高 (P < 0、05)；与LC组比较，LCS组MDA[3.08±0.52 vs. 4.16±0.19]含量、Fis1[1.48±0.39 vs. 1.96±0.31]表达水平升高，SOD[67.4±1.32 vs. 45.9±1.52]活力、HO-1[2.25±0.18 vs. 1.78±0.19]、p38[1.78±0.23 vs. 1.12±0.29]表达水平降低 (P < 0、05)。 结论 HO-1/CO抑制LPS刺激大鼠肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1表达机制与p38MAPK信号通路有关。
关键词: p38分裂原激活蛋白激酶     CORM-2     血红素加氧酶1     肺巨噬细胞     线粒体分裂蛋白Fis1     一氧化碳     脂多糖     SB203580    
Effects of CORM-2 on mitochondrial fission protein Fis1 in the Lipopolysacchoride-activated lung macrophages of rats through p38MAPK signaling pathway
Kang Yuanyuan, Shi Jia, Yu Jianbo, Fu Qiang, Zhang Yuan, Gong Lirong, Dong Shuan     
Medical University Of Tianjin Clinical Academy of Nankai; Department of Anesthesiology, Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300100, China (Kang YY, Shi J, Yu JB, Gong LR, Zhang Y, Dong SA); Department of ICU, The Fourth Central Hospital in Tianjin, Tianjin 300100, China (Fu Q)
Corresponding author: Yu Jianbo, Email:jianboyu99@sina.com
Abstract: Objective To investigate the effects of CORM-2 via p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) signaling pathway on the expression of the mitochondrial fission protein 1 (Fis1) in lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse pulmonary macrophages. Methods The rat subculture alveolar macrophages were seeded on 96 well plates with 2 ×105 /ml densities. After 24 hours of culture, it was divided into 4 groups by random number table method: normal control group (group C), group LPS (group L), CO releasing agent CORM-2+LPS group (group LC), p38MAPK inhibitor SB203580+CORM-2+LPS group (group LCS). When the cells were incubated for 24 hours, the mitochondrial MDA content and SOD activity were determined by ELISA kit, the levels of HO-1、mitochondrial fission protein Fis1 and p38 were determined by Western blot, the expressions of HO-1 and mitochondrial fission protein Fis1 were detected by RT-PCR. Results Compared with the C group, the levels of MDA[(2.43±0.12) vs.(3.59±0.07)], HO-1[(1.31±0.27)vs.(1.65±0.41)], Fis1 [(1.27±0.23)vs.(1.65±0.41)] and p38 [(1.01±0.24) vs.(1.36±0.17)] in group L were increased, and the activity of SOD [(81.7±1.62)vs.(54.7±1.62)] was decreased (P < 0.05); Compared with the group L, the MDA content[(3.59±0.07) vs. (3.08±0.52)] and the level of Fis1[(2.01±0.35) vs.(1.48±0.39)] in group LC were down-regulated, and the levels of SOD[(54.7±1.62) vs.(67.4±1.32)]、and the expressions of HO-1[(1.65±0.41) vs.(2.25±0.18)] and p38[(1.36±0.17)vs.(1.78±0.23)] were up-regulated (P < 0.05). Compared with the group LC, the MDA content[(3.08±0.52) vs.(4.16±0.19)] and the expression of Fis1[(1.48±0.39) vs. (1.96±0.31)] in group LCS were increased, and the level of SOD[(67.4±1.32) vs. (45.9±1.52)]、and the expressions of HO-1[(2.25±0.18) vs.(1.78±0.19)] and p38[(1.78±0.23) vs. (1.12±0.29)] were decreased (P < 0.05). Conclusions HO-1/CO system inhibits the expression of Fis1 in LPS-induced lung macrophages, which may be regulated by p38MAPK signaling pathway.
Key words: p38 mitogen-activated protein; Heme-oxygenase 1     Pulmonary macrophage     Mitochondrial fission protein kinase Fis1     Carbon monoxide     Lipopolysaccharide    

在内毒素休克发生发展的过程中，肺脏是最容易受到损伤的器官之一。研究表明，氧化应激可能是脓毒症多器官功能障碍的重要原因之一，而线粒体动力学变化与氧化应激密切相关[1-2]。Fis1是重要的线粒体分裂蛋白分子, 位于线粒体外膜。正常细胞内线粒体以膜网络管状结构存在来维持能量平衡；当细胞受损时，Fisl表达升高，通过促进线粒体裂解诱导细胞凋亡，而Fis1缺失突变的细胞中线粒体分裂受到抑制，说明Fis1是调节线粒体分裂的重要分子[3]。血红素加氧酶1(heme oxygnase-1, HO-1) 是血红素代谢的限速酶，催化血红素降解, 最终形成等摩尔的胆绿素、一氧化碳 (carbon monoxide, CO) 和游离铁。HO-1/CO组成了机体质量要的内源性保护系统，参与多种疾病及病理过程，通过抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等多重机制发挥组织器官保护作用[4-5]。本课题组前期研究结果表明，HO-1与线粒体动力学变化密切相关，但具体机制尚不明确[6]。研究表明，一氧化碳可上调p38MAPK的表达，HO-1可通过CO反向作用于p38MAPK信号通路[7-8]。研究证实，p38MAPK在参与急性肺损伤的炎症反应和细胞凋亡等机制中发挥了重要的作用[9-10]，成为各领域研究的热点。本研究拟探讨CORM-2通过p38分裂原激活蛋白激酶 (p38MAPK) 信号通路对脂多糖 (LPS) 刺激大鼠肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1的影响, 为阐明p38MAPK信号通路抑制线粒体分裂的机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

肺泡巨噬细胞NR8383(ATCC公司，美国)；F12K培养基、胎牛血清 (Gibco公司，美国)；青霉素和链霉素 (南京凯基生物公司，中国)；LPS、胰蛋白酶、CORM-2、DMSO、SB203580 (sigma公司，美国)。

1.2 细胞培养

用含有10%胎牛血清、1%青链双抗的F12k培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养孵箱内培养大鼠肺泡巨噬细胞。待细胞融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶将贴壁细胞消化以1: 4比例传代培养。

1.3 主要方法 1.3.1 分组及处理

将密度2×105个/ml的传代细胞接种于96孔培养板，200 μL/孔，达到80%融合后将细胞分为正常对照组 (C组)、LPS组 (L组)、CO释放剂CORM-2+LPS组 (LC组)、p38MAPK抑制剂SB203580+CORM-2+LPS组 (LCS组)。L组加入10 μg/mL LPS；LC组先加入100 μmol CORM-2，30 min后加入10 μg/ml LPS；LCS组加入10 μmol SB203580，1 h后加入100 μmol CORM-2, 30 min后加入10 μg/mL LPS。

1.3.2 氧化应激测定

细胞孵育24 h时收集细胞上清液，3 000 r/min，离心10 min。采用硫代巴比妥酸法测定血清MDA含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，严格按照试剂盒 (南京建成生物有限公司) 说明书进行操作。

1.3.3 RT-PCR

采用RT-PCR法检测Fis1、HO-1 mRNA表达。Trizol法提取细胞总RNA, 按逆转录试剂盒 (TaKaRa code DRRO47A) 说明书进行逆转录。β-actin上游引物5’-GCCTCAGATCGTCGTAGTGG-3’，下游引物5’-TGCTTCAACTCCATTTTCTTCTCC-3’，长度187 bp；Fis-1上游引物5’-TACCCCGAGGCTGTCCTAAG-3’，下游引物5’-CAGGACATTAGGCCCAGAGC-3’，长度147 bp；HO-1上游引物5’-GAATCGAGCAGAACCAGCCT-3’，下游引物5’-CTCAGCATTCTCGGCTTGGA-3’，长度135 bp；采用20 μL体系进行PCR反应，反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，59℃退火延伸30 s，共40个循环。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT值反映目的基因的相对表达量。

1.3.4 Western blot

细胞孵育24 h时，取细胞裂解液，采用Western blot法测定HO-1、Fis1和p38的表达。蛋白电泳分离后，半干法转膜并封闭2 h；洗膜后分别加入稀释度为1: 1 000的HO-1、Fis1和p38的兔抗大鼠单克隆抗体 (sigma公司，美国) 和β-actin，摇匀2 h，4 ℃下孵育过夜；洗涤后加入稀释度1: 10 000的山羊抗兔二抗 (sigma公司，美国)，室温摇床杂交1.5 h；采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白光密度值与β-actin吸光度值的比值反映p38MAPK蛋白的表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差 (x ±s) 表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 氧化应激测定结果

与C组比较，L组MDA含量上调 (t=-2.707, P=0.014)，SOD活力降低 (t=4.112, P=0.001)，差异具有统计学意义；与L组比较，LC组MDA含量下调 (t=-2.361, P=0.030)，SOD活力升高 (t=2.390, P=0.029)，差异具有统计学意义；与LC组比较，LCS组MDA含量上调 (t=-3.073, P=0.007)，SOD活力降低 (t=3.588, P=0.003), 差异具有统计学意义，见表 1。

表 1 MDA含量和SOD活力的比较 (n=4, x ±s) Table 1 The comparison of MDA content and SOD activity (n=4, x ±s)
指标 C组 L组 LC组 LCS组
MDA 2.43±0.12 3.59±0.07a 3.08±0.52b 4.16±0.19ac
SOD 81.7±1.62 54.7±1.62a 67.4±1.32b 45.9±1.52ac
注：与C组比较, aP < 0.05；与L组比较，bP < 0.05；与LC组比较，cP < 0.05
表选项
2.2 RT-PCR结果

与C组比较，L组Fis1(t=-3.578, P=0.005) 和HO-1(t=-3.607, P=0.002) 表达上调, 差异具有统计学意义；与L组比较，LC组Fis1表达下调 (t=-3.917, P=0.001)，HO-1表达上调 (t=2.186, P=0.0042), 差异具有统计学意义；与LC组比较，LCS组Fis1表达上调 (t=-2.255, P=0.037)，HO-1表达下调 (t=2.122, P=0.048)，差异具有统计学意义，见表 2。

表 2 Fis1、HO-1和p38的表达 (n=4, x ±s) Table 2 The expression of Fis1, HO-1 and p38(n=4, x ±s)
指标 C组 L组 LC组 LCS组
Fis1 1.27±0.23 2.01±0.35a 1.48±0.39ab 1.96±0.31ac
HO-1 P38 1.31±0.27 1.01±0.24 1.65±0.41a 1.36±0.17a 2.25±0.18 1.78±0.23ab 1.78±0.19ac 1.12±0.29ac
注：与C组比较, aP < 0.05；与L组比较，bP < 0.05；与LC组比较，cP < 0.05
表选项
2.3 Western blot结果

与C组比较，L组Fis1、HO-1和p38(t=-3.489, P=0.003) 表达上调；与L组比较，LC组HO-1和p38(t=-2.952, P=0.011) 表达上调，Fis1表达下调；与LC组比较，LCS组HO-1和p38(t=2.804, P=0.015) 表达下调，Fis1表达上调，差异具有统计学意义，见图 1, 表 2。

图 1 p38、HO-1 and Fis1表达的比较 Figure 1 The expression of p38
图选项
3 讨论

SOD与MDA作为氧化应激指标，可间接反映细胞损伤情况[10]。本研究表明，与对照组比较，内毒素性急性肺损伤组肺巨噬细胞氧自由基增多，抗氧化能力降低，提示成功制备了肺巨噬细胞内毒素性急性肺损伤模型。本研究分别参照文献[11-12]选择CORM-2和p38MAPK抑制剂SB203580的给药剂量。HO-1催化血红素降解形成CO，此为内源性CO最主要来源。研究发现, HO-1/CO组成机体质量要的内源性保护系统，参与体内多种生理和病理过程[13]。外源性CO的应用来源主要是CO气体和一氧化碳释放分子。CORM-2是过渡金属化合物钌的羰基化合物二聚体分子，能够缓慢释放CO, 是一种安全的外源性CO给予方式[14]。因此CORM-2广泛用于模拟内源性CO对机体组织应激损伤作用机制等的研究[15-16]。

p38MAPK家族是丝氨酸-苏氨酸激酶，属于应激激活激酶，在巨噬细胞中，p38MAPK激活参与抗炎及抗氧化作用。本研究结果表明，肺巨噬细胞孵育24 h时，给予CORM-2的肺巨噬细胞p38MAPK信号通路被激活致HO-1表达水平上调；而给予SB203580的肺巨噬细胞，p38MAPK信号通路受抑制致HO-1表达水平下调，表明p38MAPK信号通路介导了LPS攻击肺巨噬细胞诱发肺损伤时HO-1的表达上调。

哺乳动物体内线粒体分裂相关蛋白Fis1大量表达时，可增加线粒体分裂，从而导致细胞凋亡[3]。本实验结果表明，给予CORM-2的肺巨噬细胞通过激活p38MAPK信号通路致Fis1表达下调；而给予p38MAPK抑制剂SB203580的肺巨噬细胞，p38MAPK信号通路受抑制致Fis1表达上调，表明p38MAPK信号通路抑制LPS刺激肺巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Fis1的表达。

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