心搏骤停 (CA) 为急诊医学常见的急症之一，美国和加拿大急救医疗系统收治的CA发生率约为每年 (50~55)/10万^[1]，其中约86%的患者接受了心肺复苏 (CPR)，初步判断成功CPR的标志是自主循环恢复 (ROSC)。CPR后的患者有25%~50%能恢复自主循环，但神经功能恢复的患者仅2%~10%^[2]。CA后海马区对缺氧尤其敏感，循环停止4~6 min即可出现不可逆性脑损害^[3]。临床和基础研究一直在试图寻找能有效提高脑复苏质量的治疗方法或药物，虽然取得了一些肯定的结果，但仍缺乏真正改善脑复苏预后的治疗方案。因此，关于脑复苏的探索具有重大意义。骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 作为近年的研究热点，为复苏后脑功能的恢复开辟了一个新的前景。研究表明，在体外诱导培养MSCs具有向神经元前体细胞或神经元样细胞分化的潜力^[4]。多种局灶脑缺血动物实验模型中MSCs移植后能成功到达损伤的脑组织，挽救半暗带损伤的神经元，诱导神经的再生和功能的恢复^[5]。目前MSCs移植治疗全脑缺血，尤其是CA导致的全脑缺血仍较少。本研究旨在证明BMSCs可改善CA后大鼠神经功能预后，为探索BMSCs在CA后脑保护机制提供一定的参考价值。

两个批次的健康雄性SPF级Sprague-Dawley (SD) 大鼠，体质量100~110 g的幼龄大鼠用于获取原代BMSCs，体质量250~350 g的30只成年大鼠用于造模，所有大鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，批号SCXK (京)2012-0001。

PE标记小鼠抗大鼠CD11b、PE标记小鼠抗大鼠CD90、FITC标记小鼠抗大鼠CD29、FITC标记小鼠抗大鼠CD45(BioLegend公司)；携带绿色荧光蛋白的慢病毒 (上海吉玛制药有限公司)；CO₂培养箱 (Sanyo公司)；倒置显微镜 (ZEISS公司)；流式细胞仪 (BD公司)；小动物呼吸机 (上海奥尔科特科技有限公司)；BL-420S生物机能实验系统 (成都泰盟科技有限公司)；荧光显微镜 (Olympus公司)。

原代BMSCs取材采用贴壁细胞培养法。使用流式细胞仪法鉴定BMSCs，即CD29、CD90阳性，CD45、CD11b阴性，移植前使用绿色荧光蛋白 (GFP) 转染标记BMSCs。

假手术组 (sham组，n=10)，大鼠气管插管，股动脉置管。心搏骤停组 (CA组，n=10)，经窒息法诱导心搏骤停后进行CPR，经尾静脉注射0.5 ml无菌生理盐水。干细胞治疗组 (BMSCs组，n=10)，CPR成功后经尾静脉注射同体积的BMSCs。

用窒息法建立大鼠CA模型。术前按照0.1 ml/100 g腹腔注射戊巴比妥钠，大鼠气管插管并股动脉置入已肝素化的PE50管，连续监测大鼠平均动脉压。分别于上肢，双下肢插入电极连续监测大鼠心电变化。待大鼠清醒后，按照0.1 ml/100 g的剂量注入维库溴铵注射液。CA 5 min后给予机械纯氧通气，潮气量为0.6 ml/100 g，呼吸频率100次/min，吸呼比为1: 1，并进行胸外按压，频率为200次/min。按压后2 min按0.005 mg/kg给予肾上腺素，必要时可间隔2 min重复使用。操作过程中诱导CA的判断标准及ROSC的标准均严格按照文献规范进行^[6-7]。经10 min CPR后未能ROSC者为CPR失败。随机 (随机数字法) 抽取GFP标记的BMSCs，消化后用PBS配置成每0.5 ml含1×10⁶个细胞待ROSC 1 h后经尾静脉注射，分别在移植后3 d和7 d处死大鼠，留取脑组织备用。

经上述步骤处死大鼠后，迅速打开颅骨取出海马组织放入4%多聚甲醛液中浸泡3 d，脱水后制成20μm厚的冰冻切片。将组织切片置于荧光显微镜观察海马组织中GFP-BMSCs。组织切片行HE染色观察海马组织病理形态。

取出剩余脑组织，精确分析天平称质量后，放入95 ℃恒温干燥箱烘烤72 h至恒重后，再置于电子天平上精确称质量。含水量 (%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

计量资料以均数±标准差 (x ±s) 表示，采用SPSS 19.0软件进行分析处理，统计方法为单因素方差分析 (ANOVA)，采用Homogeneity of Variances test做方差齐性检验，以SNK-q法进行两两比较，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

利用25 cm²培养瓶采用贴壁法培养BMSCs，24 h后有少数长梭形细胞贴壁生长 (图 1)，72 h后可见稀疏条索状细胞有的呈集落聚集，有的呈散在分布，培养5~6 d细胞增殖明显，相互紧密贴合，第7~9天可见细胞融合80%~90%，呈旋涡状铺满瓶底。此时可进行第一次传代。此后每间隔4 d传代一次。第三代细胞生长迅速，多为条索状、漩涡形排列，也有菱形凸起伸出，BMSCs逐渐纯化，圆形细胞逐渐减少 (图 2)。

图 1 BMSCs 24 h半量换液后 (×100) Figure 1 Half of the medium waschanged after 24 h (×100)

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图 2 P3细胞 (×200) Figure 2 The 3rd generation cells (×200)

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BMSCs经过流式细胞仪检测，表达CD29、CD90阳性率为97.15%、99.02%，表达CD45、CD11b阳性率为0.36%、1.45%。最终可以判定培养的细胞为BMSCs，可以用于下一步移植研究^[8-9]。(图 3)。

图 3 流式细胞仪法检测细胞表面标志 Figure 3 BMSCs by flow cytometry analysis

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将冰冻切片置于倒置荧光显微镜下观察可发现绿染的BMSCs，ROSC后第3天即可于海马区观察到BMSCs，且随着时间延长，仅有少数死细胞，BMSCs形态未见明显改变，说明BMSCs在海马组织中生长良好，且BMSCs具有归巢于全脑缺血后受损部位的特性。见图 4。

图 4 移植3 d、7 d后可检测到GFP标记的BMSCs (×200) Figure 4 The GFP-labeled BMSCs in hippocampus under a fluorescent microscope at day 3, and day 7 after transplatation (×200)

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此部分实验中20只大鼠全部诱发CA成功。复苏后大鼠表现不同程度的抽搐、惊厥、精神萎靡，BMSCs移植组上述症状较为少见，且食欲良好，活动较CA组敏捷。sham组无任何上述症状。

通过HE染色发现，假手术组海马区结构清楚，细胞排列紧密，细胞核形态完整，核圆而大，染色浅，胞质丰富。CA组3 d、7 d海马区呈弥漫性损伤，海马区结构紊乱，神经元明显变性，均可见较多变性、深染、固缩的神经细胞。神经细胞胞浆变红，组织疏松，细胞间隙增大，有大量空泡形成，形态学上称之为“噬红样变”(图 5-7箭头所指处)。BMSCs移植组神经细胞变性、坏死数量减少，间质水肿减轻，空泡变性较少，综合各组病理结果改变说明BMSCs移植能改善海马组织缺血病理变化，对复苏后脑缺血易损部位具有保护作用。见图 5、图 6、图 7。

图 5 sham组HE染色 (×200) Figure 5 HE dyeing results in the sham group (×200)

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图 6 CA组HE染色 (×200) Figure 6 HE dyeing results in the CA group (×200)

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图 7 BMSCs组HE染色 (×200) Figure 7 HE dyeing results in the CA group (×200)

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由实验结果可知脑水肿在ROSC后3 d达到最高峰。CA后大鼠脑水含量均明显升高，结果具有统计学意义 (均P < 0.05)，且随着时间延长，脑水含量具有下降的趋势。BMSCs治疗组脑水含量均低于CA组 (均P < 0.05)。

由于目前CA后的病理生理机制仍未阐明，仍需要在实验室不断模拟CA的模型，所以寻找一种还原度高，操作简易的动物模型十分必要。目前所采用的实验动物有狗、猪、兔、猫、大鼠、小鼠等^[10]。大鼠作为最常用的实验动物，有研究证实它在心脏骤停和复苏期间的血流动力学、酸碱平衡及代谢等方面与大动物的变化基本一致^[11]，且大鼠相对于上述动物具有易于饲养、价格适中的特点，所以本实验选用SD大鼠作为实验动物。

目前CPR模型常用的制备方法有窒息法、致颤法、高钾诱发心律失常等办法，上述方法均能模拟心脏停搏时体内病理生理改变^[12-14]。临床上CA有70%~80%是由于室颤导致，致颤法无疑是还原度最高的一种选择，但是由于致颤法需要心脏起搏电极和除颤仪等设备，并且刺激参数上具有较大差异，使实验的质控存在一定的不均一性^[15]。综合上述考虑，本研究采用维库溴铵窒息诱导的CA模型，复苏成功率高，且注射肌松药维库溴铵后可避免窒息导致的强烈应激反应，对动物的全身影响小，符合伦理学规定。

本实验使用经尾静脉途径输注BMSCs，避免了对脑组织的二次损伤。当前常用的移植途径有立体定向侧脑室注射、颈动脉、股静脉途径等^[16]。侧脑室注射虽然经证明定植于缺血区域的细胞数多，但是因为还需要进行一次手术操作，操作复杂且耗费时间。更重要的是大脑结构复杂，复苏后本是脑水肿状态，立体定向移植后所带来的液体挤压有可能会对脑神经带来损伤，更加重了脑神经功能损害，故临床价值较低。本研究采用静脉移植的办法简易快捷，不易引起感染，可一次性输入大量细胞，且病患接受度高，可以考虑作为临床上的移植途径^[17]。

脑组织损伤由于其自身修复能力有限，目前尚没有有效的治疗手段^[18]。当前BMSCs较多的应用于局灶性缺血模型，其对神经功能的恢复作用较为肯定，对CA导致的全脑缺血的研究较少，但也有报道全脑缺血的患者能从中获益^[19]。本研究将GFP-BMSCs移植入大鼠体内，荧光显微镜下观察显示各时间点均能在海马区损伤部位发现发绿色荧光的BMSCs，说明了BMSCs的归巢特性。利用BMSCs的这种生物学特性，Lin等^[19]和Horita等^[20]分别利用PIGF和GDNF以慢病毒为基因载体转染BMSCs，可显著改善脑缺血损伤。BMSCs可表达外源基因，通过基因修饰技术使BMSCs高表达神经营养因子从而修复受损脑组织，基因治疗将成为将来BMSCs移植中的一个热点^[21]。

本研究发现大鼠全脑缺血后神经细胞明显变性，组织疏松，有大量空泡形成，有“噬红样变”细胞出现。而BMSCs治疗组可明显减少海马区神经细胞的凋亡和坏死，减轻细胞受损程度，这说明了尾静脉移植BMSCs可减轻全脑缺血后脑细胞的损伤，具有神经元保护效应。而对脑水含量测定的检测也证实了BMSCs能改善全脑缺血后脑水肿。目前认为MSCs在脑复苏中的原理包括分化为相关细胞进行修复、免疫调节、促进血管形成和神经突触发生、抗凋亡、神经保护和神经营养因子的分泌等^[22]，其具体的机制还需进一步的实验研究。