大黄最早记载于《神农本草经》，是临床常用中药之一。研究发现大黄具有多种作用, 如可减轻内毒素性低血压，消除氧自由基，降低再灌注期血浆、肺、小肠等内源性一氧化氮的水平，降低肠、肝、肺毛细血管通透性，减轻内毒素引起的肠壁血管通透性增加，防止肠道细菌移位及内毒素进入血循环等^[1-3]。在临床上，大黄应用于严重创伤、感染性休克、MODS等危重病、预防及治疗胃肠功能衰竭，取得了良好效果。然而大黄饮片煎煮、泡水等方式在使用上存在着不便，且目前普遍认为传统水煎法蒽醌成分提取率较低。本研究采用超声法自制生大黄灭菌液，并应用于脓毒症大鼠模型，观察生大黄灭菌液对于脓毒症的疗效及对失控炎症反应的影响。

生大黄饮片 (购于第二军大学附属长征医院中药房) 粉碎，用40目筛网筛取生大黄粉备用。

(1) 超声波法。5 g生大黄粉加8倍量的水与酒精混合物作为溶剂 (质量体积比)，超声频率20 KHz，超声功率300 W，90%乙醇溶液，在80 ℃条件下，超声萃取30 min，回收溶剂，浓缩，加蒸馏水调至50 mL。采用超高温瞬时杀菌，杀菌温度控制在132~135 ℃，维持4~5 min，出料温度控制在 (95±2)℃，封装备用。(2) 水煎法。生大黄粉5 g，加水约50 mL，煎煮1 h，用纱布过滤。残渣以适量水冲洗后过滤，合并滤液并定容至50 mL。

使用分光光度法对总蒽醌成分进行检测。

30只雄性SD大鼠8周龄[购自第二军医大学医学实验动物中心，许可证号:SCXK (沪) 2007-0003]，体质量约250~300 g，随机 (随机数字法) 分为盲肠结扎穿孔 (CLP) 组和生大黄组。

CLP组大鼠采用盲肠结扎穿孔法进行脓毒症造模。脓毒症模型：术前禁食12 h，不禁水，称重，3%戊巴比妥 (45 mg/kg) 腹腔注射麻醉，补充麻醉剂量10 mg/(kg·h)。仰卧位四肢固定于手术台上，用动物剃毛器剔腹部毛发。常规消毒腹部术区，术中无菌操作。腹壁正中作一长约2 cm竖切口，进入腹腔后游离组织找到回盲部，分离出大鼠盲肠，采用中度脓毒症结扎方法50%结扎盲肠，用20号注射针头于结扎段贯穿2次，并挤出少量粪便，将回盲肠重新回纳腹腔，3号线逐层缝合腹壁切口。术后皮下注射生理盐水抗休克 (10 mL/kg)。造模后30 min CLP组进行糖盐水 (2 mL/100 g) 灌胃，此后每天灌胃1次。

生大黄组：造模方法同前，造模后30 min予生大黄灭菌溶液进行灌胃，此后每天灌胃1次。灌胃大黄剂量2.0 g/kg，抽取等量生大黄灭菌提取液进行灌胃。

以造模时间为起点，每24 h为一节点，观察记录各组大鼠死亡情况，总观察时间7×24 h。

54只雄性SD大鼠8周龄，体质量约250~300 g，随机 (随机数字法) 分为3组：假手术组、CLP组、生大黄组。CLP组、生大黄组操作方法同前。假手术组术麻醉、消毒方法同前，暴露腹腔后，不进行盲肠结扎及穿刺，仅翻动腹腔内肠管，逐层缝合腹壁切口。术后不注射生理盐水及灌胃。

每组随机 (随机数字法) 分为三个亚组，分别在术后12 h、24 h、48 h取血。采用眼眶静脉丛采血法，采血1.5 mL并离心取上清液，取血后处死大鼠，留取部分小肠组织 (为距回盲部10 cm小肠组织7 cm) 待测。上清液及小肠组织移入冻存管，置入-80 ℃冰箱内备用。标本收取完毕后用ELISA法检测血清TNF-α、HMGB1水平。

取48 h组小肠组织，使用蛋白质印迹法 (Western blot) 法检测HMGB1、RAGE、NF-κB P65蛋白水平。取冰冻小肠组织标本制成匀浆液，离心5 min (4 ℃，1 500 g)，加入10% SDS裂解液，120 V电泳提取蛋白并转膜，用0.5%TBST-20(包含5%的脱脂牛奶) 封闭1 h，加入兔抗HMGB1抗体 (1:500; Abcam) 或兔抗RAGE抗体 (1:500; Abcam) 或兔抗NF-κB P65抗体 (1:500; Abcam) 或β-actin抗体 (1:500; Abcam) 孵育过夜，TBST-20漂洗数次，再加入相应二抗，室温下孵育2 h，TBST-20再次漂洗。采用ECL试剂盒显影，拍照。采用Image pro plus 6.0软件对图像进行分析，以目的蛋白条带与内参条带吸光度值的比较反映目的蛋白的相对表达强度。

应用SPSS 21统计软件，计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采LSD-t检验。计数资料以率的形式表示，采用χ²检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

5组不同批次采用超声法生大黄灭菌溶液蒽醌类物质含量为 (18.53±0.17) mg/g，采用水煎法含量为 (15.35±0.29) mg/g，超声法优于水煎法，差异具有统计学意义 (P＜0.01)。

CLP组大鼠生存率为48.0%，生大黄组大鼠生存率为76.0%，生大黄组高于CLP组，差异具有统计学意义 (P=0.047)。大鼠死亡高峰期在术后48 h内 (图 1)。

图 1 两组大鼠生存曲线 Figure 1 Survival curves of rats of two groups

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同假手术组相比，经历脓毒症造模的CLP组和生大黄组大鼠，血清炎症因子水平明显上升，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。TNF-α在12 h到达高峰，然后缓慢下降。生大黄组大鼠血清TNF-α水平低于CLP组，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。HMGB1在术后缓慢上升，于48 h到达峰值。在术后12 h，生大黄组、CLP组大鼠血清HMGB1水平差异无统计学意义 (P＞0.05)；在术后24 h、48 h生大黄组大鼠血清HMGB1水平低于CLP组，差异具有统计学意义 (P＜0.05)(图 2、3)。

与假手术组比较，aP＜0.01 ；与CLP组比较，bP＜0.05 图 2 三组大鼠血清TNF-α水平 Figure 2 Serum levels of TNF-α of three groups

图选项

与假手术组比较，aP＜0.01 ；与CLP组比较，bP＜0.05 图 3 三组大鼠血清HMGB1水平 Figure 3 Serum levels of HMGB1 of three groups

图选项

48 h时生大黄组和CLP组小肠组织HMGB1蛋白水平高于假手术组，差异具有统计学意义 (P＜0.01)，CLP组高于生大黄组，差异具有统计学意义 (P=0.02)。见图 4。

与假手术组比较，aP＜0.01 ；与生大黄组比较，bP＜0.05 图 4 三组大鼠48 h小肠组织HMGB1蛋白 Figure 4 Expression of HMGB1 protein in small intestine tissue at 48 hours after operation of three groups

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48 h时生大黄组和CLP组小肠组织RAGE蛋白水平高于假手术组，差异具有统计学意义 (P＜0.01)，CLP组高于生大黄组，差异具有统计学意义 (P=0.01)。见图 5。

与假手术组比较，aP＜0.01 ；与生大黄组比较，bP＜0.05 图 5 三组大鼠48 h小肠组织RAGE蛋白 Figure 5 Expression of RAGE protein in small intestine tissue at 48 hours after operation of three groups

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48 h时生大黄组和CLP组小肠组织NF-κB活化程度高于假手术组，差异具有统计学意义 (P＜0.01)，CLP组NF-κB活化程度高于生大黄组，差异具有统计学意义 (P=0.03)。见图 6。

与假手术组比较，aP＜0.01 ；与生大黄组比较，bP＜0.05 图 6 三组大鼠48 h小肠组织NF-κB 活化水平 Figure 6 Activation of NF-κB in small intestine tissue at 48 hours after operation of three groups

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大黄主要成分为蒽醌类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等，蒽醌类物质是其主要有效成分。传统的煎煮、水泡等方法难以提取出极性较小的游离蒽醌类物质，且煎煮时长不一致，提取出的成分也存在差异。本实验采取超声法萃取，同传统水煎法进行对比，结果显示超声法优于传统水煎法。同时本研究将生大黄灭菌液应用于大鼠脓毒症模型，观察疗效及作用机制。

脓毒症是ICU常见的具有潜在生命威胁的疾病，尽管近些年，人们对脓毒症的认识及治疗水平逐渐提高，但脓毒症仍然是微生物感染导致患者的主要死亡原因。盲肠结扎穿刺法是动物实验中广泛使用的脓毒症模型，它能模拟感染引起的炎症反应、休克、脏器衰竭最终死亡的过程^[6]。本实验采取50%盲肠结扎方案模仿中度脓毒症，大鼠7 d生存率48%。予生大黄灭菌液灌胃处理后，大鼠7 d生存率上升至76% (P＜0.05)，说明生大黄灭菌液能显著提升脓毒症大鼠的7 d生存率。脓毒症涉及多种机制，其中关键环节是宿主失控的瀑布样炎症反应，笔者观察了在脓毒症中生大黄灭菌液对炎症因子的作用。

TNF-α是脓毒症早期出现的促炎因子，一方面直接加重炎症反应，另一方面上调二次炎症介质表达和其他促炎因子的释放，导致炎症反应失控^[7]。在脓毒症患者及动物脓毒症模型中，血清TNF-α水平在发病早期显著上升，上升程度和脓毒症的严重程度及预后密切相关^[8-9]。HMGB1可由粒细胞或活化的单核/巨噬细胞分泌，是在脓毒症中出现相对较晚的炎症因子。在脓毒症患者中，HMGB1及RAGE水平与患者脓毒症的严重程度、器官衰竭的程度、休克的持续时间密切相关，是脓毒症致死效应中的关键促炎因子^[10]。在本实验中，与假手术组相比，盲肠穿孔结扎后大鼠血清TNF-α、HMGB1促炎因子明显上升，分别在12 h、48 h达到高峰，说明在全身范围存在着较强炎症反应。予生大黄灌胃后，上述指标存在不同程度的下降，说明生大黄灭菌液能降低促炎因子水平，减轻炎症反应。大黄抗炎的机制目前尚未完全明确，可能与NF-κB通路有关。目前普遍认为，RAGE是HMGB1最主要的高亲和力受体，RAGE与配体相互作用激活多种过程，如炎症、增生、细胞凋亡、细胞迁移等。其下游信号通路，主要与丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路、NF-κB信号转导通路有关，激活上述通路进而上调各种炎症因子，促进炎症级联反应^[11]。而在本实验中大黄能减少HMGB1及其RAGE受体表达，减少NF-κB活化，抑制NF-κB通路，减少促炎因子的再次释放。其他研究也证明了大黄能减少NF-κB的活化^[12]，缓解HMGB1和TNF-α相互诱生的现象，减轻炎症反应发展^[13]。脓毒症往往存在着胃肠道功能障碍，胃肠道黏膜血流减少，屏障功能受损通透性增高^[14]，肠道菌群移位等，而大黄具有泻下作用，能促进肠蠕动，增加肠道黏膜血流灌注，减少内毒素产生及吸收入血，减少炎症因子释放^[15]；大黄能降低Treg细胞比例，改善Th1/Th2失衡，对大鼠肠道特异性免疫也有一定调节作用^[16]。

综上所述，本研究采用超声法萃取生大黄灭菌液，在动物实验中证明了用该法提取出的生大黄灭菌液能减轻血清TNF-α、HMGB1促炎因子水平，下调小肠组织HMGB1、RAGE蛋白水平，抑制NF-κB活性，提高脓毒症大鼠的生存率。