自噬是细胞内管理和蛋白质量控制的重要机制，通过自噬可以清除受损或有缺陷的蛋白质和细胞器如淀粉样蛋白、线粒体、内质网等来维持内环境的稳定，同时为细胞供应能量，保护细胞。本课题组近期的研究^[1-2]表明大鼠心脏骤停 (cardiac arrest, CA) 自主循环恢复 (return of spontaneous circulation, ROSC) 后早期大脑皮层神经元细胞自噬减弱，而应用雷帕霉素激活自噬可改善大鼠复苏后神经功能^[1]。亚低温治疗可以改善心肺复苏 (cardiopulmonary resuscitation, CPR) 后患者的神经功能，但其具体机制还不甚明确，亚低温是否对自噬具有影响，目前还没有确切的证据。本研究通过建立大鼠CA-CPR模型，观察亚低温治疗对自ROSC后大鼠海马CA1区神经元细胞自噬的影响，探索亚低温的脑保护机制。

本实验在中山大学卫生部辅助循环重点实验室进行。36只健康成年雄性Wistar大鼠，月龄15~16个月，体重400~428 g，由中山大学实验动物中心提供。动物购进后在SPF级动物房饲养一周，实验前晚禁食不禁水。动物麻醉用戊巴比妥钠 (Sigma公司，德国)30 mg/kg，由腹腔内注入，酌情给予1/4的首剂量维持。

麻醉成功后，固定于操作台上。胸、背部皮肤备皮。用16 G鞘管经口气管插管，接小动物呼吸机 (RODENT VENTILATOR 683. Harvard Apparatus, Inc. USA), 通气频率75次/min，潮气量15 mL/kg，根据血气分析结果调整呼吸机参数，PCO₂控制在35~45 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa) 之间。常规Ⅱ导联心电监护, 解剖动静脉后用留置针 (Becton Dickinson Medical Devices CO，Ltd, 中国苏州) 穿刺右股动静脉，术中出血较少，动脉管接高敏感换能器监测动脉血压。4通道生理信号采集分析系统 (BIOPAC SYSTEMS MAP150, Inc. MP100A-CE Santa Barbara, USA) 连续记录心率、血压信息。

36只Wistar大鼠按照文献报道的心外膜致颤的方法^[3-8]诱发VF，VF持续7 min后进行CPR，2 min后进行除颤，如此周而复始，直至ROSC，如持续15 min未ROSC，宣布复苏失败。ROSC后以随机数表法随机分为常温治疗组和亚低温治疗组。常温治疗组ROSC后用电热毯维持食道温度在36~38 ℃，亚低温治疗组动物放入控降温箱内，使食道温度维持在32~34 ℃之间^[8]，维持24 h，然后复温，速度0.5 ℃/h。ROSC后2 h和4 h每组以过量麻醉方式处死3只动物取大脑皮层，用电镜和Western blot方法观察神经元自噬的激活情况，迅速取大脑皮层液氮冷却后储存于-80 ℃冰箱，用于观察CPR后神经元自噬的激活情况。其余动物观察72 h，ROSC后24、48和72 h分别进行神经功能缺损 (neurologic deficit score，NDS) 评分。ROSC后72 h处死动物取大脑进行TUNEL染色计数海马CA1区凋亡神经元细胞数。

处理脑组织冻存标本，按照全蛋白提取试剂盒说明, 提取全蛋白, BCA法蛋白定量 (北京百泰克生物技术有限公司)。取50 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜, 5%的脱脂奶粉封闭2 h, 滴加一抗 (1:1 000) 4 ℃过夜, TBST洗膜，5 min×3次, 滴加HRB标记的二抗 (1:10 000) 室温下孵育1 h, TBST洗膜，5 min×3次, Millipore发光液浸泡1 min，Koda胶片曝光，显影、定影，计算蛋白灰度。一抗：兔单克隆抗体AMPKα (Cell Signal Technology, 2532), 兔抗大鼠单克隆抗体p-AMPKα (Cell Signal Technology, 2535)，Beclin-1(Rabbit poIycIonaIto Beclin-1，ab62557，中国香港) 和LC3 (Rabbit poIycIonaIto LC3A/B，ab849361，中国香港)。二抗：GAPDH (Proteintech Group, USA)。

NDS评分内容包括意识状态、呼吸、颅神经功能、运动感觉功能和行为5个部分，范围为0~500，0=正常，500=死亡。ROSC后24、48和72 h分别由3名不同实验者进行评分，三人的平均分为最终评分。

TUENL凋亡试剂盒购自ROCHE公司 (瑞士)。具体步骤如下：①取ROSC后72 h海马组织石蜡切片，常规脱蜡至水；②用蛋白酶K室温孵育30 min，PBS洗片后与0.3%的H₂O₂甲醇溶液室温孵育30 min，PBS洗片，与通透液在冰浴中孵育2 min；③PBS冲洗两次，加50 μL的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37 ℃孵育60 min，PBS冲洗三次；④加入50 μL转化剂－POD，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入50 μL DAB底物溶液，室温孵育30 min，TBS冲洗三次，复染2 min，树脂封片，在光镜 (OLYMPUS BX51，日本) 下观察分析结果，每张切片随机选取6个标准视野，计算每400倍视野下100像素内顶叶皮层区凋亡神经元细胞数。

常规石蜡切片，3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，高温柠檬酸盐缓冲液抗原修复，LC3 (1:100; Abcam, ab84936) 4 ℃孵育过夜，反复PBS清洗，加入FITC标志二抗IgG (1:300, Santa Cruz Biotechnology, sc-2012)，湿孵1 h。PBS冲洗后在荧光显微镜 (OLYMPUS BX51; OLYMPUS IMAGING CORP, 日本) 下观察LC3的表达，Image pro plus 6.0半定量LC3的表达。

所有数据录入SPSS 20.0统计软件包，依据正态检验 (Kolmogorov-Smirnov) 结果分别用均数±标准差 (x±s) 或中位数 (四分位数) [M (P₂₅, P₇₅)] 表示，依据正态检验结果采用单独立样本t检验或秩和检验 (Mann-Whitney rank)，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

常温组 (n=18) 和亚低温治疗组 (n=18) 各有14只和13只动物获得ROSC, 两组各有4只和6只大鼠存活到实验结束。两组动物致颤前的基本生理学参数和复苏相关指标之间差异无统计学意义 (表 1)。亚低温治疗改善ROSC后大鼠的NDS评分 (表 2)。

亚低温治疗组大鼠ROSC后2 h和4 h大脑皮层内p-AMPK水平高于常温组 (0.80±0.16) vs.(0.24±0.12)，(0.99±0.12) vs.(0.40±0.16)，均P < 0.05，(图 1A)。常温组ROSC后2 h和4 h Beclin-1的表达水平分别为 (0.52±0.11) 和 (0.57±0.07)，低于亚低温组ROSC后2 h和4 h的 (0.79±0.09) 和 (0.85±0.04)，P值分别为0.028和0.003 (图 1C)。LC3Ⅱ/Ⅰ常温组ROSC后2 h和4 h分别为 (0.24±0.08)、(0.31±0.06)，明显低于于亚低温组的 (0.43±0.09) 和 (0.47±0.08)，P值分别为0.032和0.035 (图 1C)。

ROSC后亚低温治疗增加大脑皮层内p-AMPK水平 (A)，增加自噬标志物Beclin-1表达 (B) 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例 (C)，显著高于常温治疗组。aP < 0.05，bP < 0.01，O为正常大鼠，2 h和4 h分别为ROSC后2 h和4 h 图 1 亚低温对p-AMPK和自噬标志物LC3表达的影响 Figure 1 Effects of mild hypothermia on the expression of p-AMPK and autophagy marker LC3

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ROSC后72 h常温组CA1区神经元细胞内可见较多的凋亡细胞，凋亡指数为 (18±6)/400像素，亚低温组的凋亡指数相对较小，为 (14±5)/400像素，P=0.01(图 2)。

图 2 ROSC后亚低温治疗减少大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡 (图中含棕褐色颗粒的为凋亡细胞) Figure 2 Mild hypothermia treatment after ROSC reduces apoptosis of hippocampal CA1 neurons in rats (The apoptotic cells containing brown granules)

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亚低温组CA1区神经元细胞胞浆内可见明显的LC3颗粒形成，LC3颗粒相对面积为 (35.4±5.2)%，而常温组神经元细胞浆内LC3颗粒较少，相对面积为 (24.1±2.8)%，两组之间差异有统计学意义，P=0.003(图 3)。

ROSC后常温治疗组海马CA1区神经元胞浆内可见少量LC3颗粒形成，而亚低温组海马CA1区神经元胞浆内可见明显的LC3颗粒形成，P < 0.05 图 3 亚低温治疗增加海马CA1区神经元细胞LC3颗粒的形成 Figure 3 Mild hypothermia therapy increases the formation of LC3 particles in hippocampal CA1 neurons

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自噬是营养底物缺乏时细胞的适应性反应，在缺血-再灌注等各种因素刺激下，细胞启动自噬来提高细胞对缺血缺氧的耐受力，对细胞起到一定保护作用^[9]。由轻度或中度脑缺血或缺氧引起的生理水平的自噬具有保护作用 (通过分解代谢产生能量阻止细胞坏死，通过清除受损的线粒体抑制细胞凋亡)；由严重脑缺血或缺氧引起的高水平的自噬可导致细胞死亡，而自噬能力的不足可以导致衰老和耐受缺血缺氧的能力下降^[10-12]。笔者前期的研究结果表明大鼠室颤7 min，ROSC后2~4 h神经元细胞自噬减弱，而通过激活自噬可减轻神经元细胞损伤^[1-2]。本研究结果表明ROSC后亚低温治疗可激活大鼠海马CA1区神经元细胞自噬，减少神经元细胞凋亡，改善神经功能。

降低脑氧代谢率是亚低温的主要保护机制之一^[13-14]。在22~37 ℃范围内，脑温降低和氧代谢率降低成线性关系；当脑温33 ℃时，氧代谢率减少20% ~25%，而神经保护作用却可达50%~80%，大大超过了实际检测到的氧代谢率降低幅度，同时亚低温治疗过程中细胞内的ATP利用率反而增加^{[15, 20-21]}，可能有其他机制参与了亚低温状态下神经元细胞的能量供应和保护作用。在能量缺乏的情况下，AMPK的激活是启动自噬的关键因素^{[9, 16]}。本研究表明Wistar大鼠ROSC后亚低温治疗使大脑皮层内p-AMPK水平增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加，增加AMPK活性、促进自噬可能和亚低温的脑保护作用有关。研究发现尽管亚低温可以抑制大多数蛋白的合成，但对于AMPK的活性却没有影响^[17]，激活AMPK是低温预适应的重要保护机制^[18]。在亚低温状态下葡萄糖摄取减少和糖酵解、脂肪酸氧化率降低，ATP产生减少的情况下，激活AMPK促进自噬，清除受损的细胞器，维持细胞的稳定，同时促进能量的产生 (ATP供应增多)，增强对缺血缺氧损伤的耐受性^[19]，这对于维持细胞的生存具有非常重要的意义。

笔者前期研究表明^[1-2]ROSC后早期Wistar大鼠大脑皮层自噬水平、p-AMPK水平降低，本研究发现亚低温却可以上调p-AMPK的表达和促进自噬，其原因可能为：首先VF导致大脑皮层缺血，ATP产生减少，进而激活AMPK促进自噬；接着ROSC，大脑皮层血流恢复，ATP水平迅速上升，AMPK失活，自噬减弱，随后ROSC后亚低温降低糖、脂肪的代谢速率，使细胞内ATP水平适度降低转而激活AMPK促进自噬。但亚低温是如何调控神经元自噬，有待进一步研究阐明。

总之，心肺复苏后亚低温治疗促进大鼠海马神经元细胞自噬，减少神经元细胞凋亡。