2017, Vol. 26
机械通气是救治危重症患者及治疗急性呼吸衰竭的重要手段，但机械通气不当会诱发或加重肺损伤，称为呼吸机相关性肺损伤 (VILI)，VILI是多种致伤机制综合作用的结果，可导致严重后果。1-磷酸鞘氨醇 (S1P) 是一种天然溶血磷脂，广泛分布于生物体内，研究发现，S1P通过对细胞迁移、细胞凋亡、炎症反应以及血管通透性的调控，在多种疾病的病理生理改变过程中发挥了重要作用[1-2]。S1P类似物FTY720已广泛应用于临床，本研究观察FTY720预处理对VILI大鼠的影响，探讨S1P 1型受体在其中的作用，为临床防治VILI提供参考。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器芬戈莫德 (fingolimod，FTY720)(Selleck公司，美国)；3-amino-4-(3-hexylphenylamino)-4-oxobutyl phosphonic acid (W146)(Cayman Chemical公司，美国)；TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒 (上海西唐生物科技有限公司)；BCA法蛋白检测试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司)；HX-101E型小动物呼吸机 (成都泰盟科技有限公司)；血气分析仪 (i-STAT公司，美国)；光镜显微镜 (Motic公司，日本)；H-7500型透射电镜 (Hitachi公司，日本)；FACSCalibur流式细胞仪 (BD公司，美国)。
1.2 动物分组与处理健康成年雄性SD大鼠40只，体质量300~350 g，3.0~3.5个月龄，由温州医科大学实验动物中心提供 (许可证号：SCXK浙2015-0001)。采用随机数字表法，将其分为4组 (n=10)：常规潮气量组 (TV组，潮气量8 mL/kg)、大潮气量组 (HV组，潮气量40 mL/kg)、大潮气量+FTY720 10 mg·kg-1·d-1灌胃7 d预处理组 (HF组)、大潮气量+FTY720 10 mg·kg-1·d-1+S1P1受体拮抗剂W146 1 mg·kg-1·d-1灌胃7 d预处理组 (HFW组)。FTY720及W146的剂量及给药时机选择参考文献[3-4]
VILI动物模型：动物实验前禁食8 h，禁水2 h。腹腔注射20 %乌拉坦8 mL/kg麻醉后，经左股静脉置管用于输液和给药，间断静脉注射维库溴铵1 mg/kg维持肌松，以微量注射泵输注0.9 %氯化钠溶液 (10 mL·kg-1·h-1) 补液。气管切开后插入气管导管，接小动物呼吸机行机械通气，呼吸频率40次/min，吸呼比1: 2，吸入气体为空气。各组大鼠按照设定潮气量行机械通气4 h后测定各项指标。
1.3 标本采集及检测机械通气4 h时取左股动脉血样测定PaO2。开胸迅速取出心脏和肺，4 ℃ 0.9 %氯化钠溶液冲洗。取适量新鲜左上肺组织，经剪碎、胰蛋白酶消化后，过滤除去细胞碎片，离心收集细胞悬液，调整样品浓度为1×106个/mL，经钙结合蛋白Ⅴ-碘化丙啶 (AnnexinⅤ-PI) 双染色、孵化后应用FACSCalibur流式细胞仪检测，计算凋亡率。取左下肺组织用10 %甲醛固定后，常规脱水、包埋、切片、HE染色并用光镜观察肺组织病理学结果。另取肺组织制成1 mm×1 mm ×1 mm，用戊二醛溶液预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，经EPON81包埋，制备超薄切片后行铀-铅双重染色，电镜下观察肺组织超微结构。结扎左肺门，摘取剩余左肺，称湿质量后，置烤箱 (80 ℃，72 h) 烤至恒重，称干质量，计算湿干重比 (W/D值)。右肺行支气管肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液 (BALF)5 mL，4 ℃下2 000 r/min离心10 min (离心半径13.5 cm)，取上清液-70 ℃冻存，采用ELISA法测定BALF中TNF-α、IL-1β含量，BCA法测定BALF及血清蛋白含量，计算肺通透性指数PPI (即BALF与血清的总蛋白浓度之比)。
1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 动脉PaO2、肺组织W/D值、PPI和肺细胞凋亡率与TV组比较，HV、HF、HFW组PaO2降低，肺组织W/D值、PPI、总蛋白和肺组织细胞凋亡率升高 (P＜0.05)；与HV组比较，HF组、HFW组PaO2升高，W/D值、PPI降低，HF组肺凋亡率降低 (P＜0.05)，HFW组总蛋白、肺细胞凋亡率与HV组差异无统计学意义 (P>0.05)；与HF组比较，HFW组W/D值、PPI、肺细胞凋亡率升高 (P＜0.05)，两组间PaO2、总蛋白差异无统计学意义 (P>0.05)，见表 1、图 1。
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| 图 1 各组大鼠肺组织细胞凋亡流式细胞仪检测结果 Figure 1 Apoptosis rate in lung tissue of rats |
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| 组别 | PaO2(mmHg) | W/D值 | PPI | 总蛋白 (mg/mL) | 肺细胞凋亡率 (%) |
| TV组 | 73.6±8.9 | 3.12±0.27 | 0.08±0.03 | 5.8±2.1 | 10.6±2.9 |
| HV组 | 50.5±6.0a | 5.12±0.56a | 0.30±0.06a | 15.4±5.6a | 48.5±6.7a |
| HF组 | 65.9±10.3ab | 3.85±0.37ab | 0.14±0.03ab | 8.9±2.5 ab | 25.6±5.3ab |
| HFW组 | 59.7±7.8ab | 4.44±0.30abc | 0.19±0.09abc | 10.4±2.7a | 41.3±6.8ac |
| 注：与TV组比较，aP＜0.05；与HV组比较，bP＜0.05；与HF组比较，cP＜0.05 | |||||
与TV组比较，HV、HF、HFW组BALF中TNF-α、IL-1β含量升高 (P＜0.05)。与HV组比较，HF组BALF中TNF-α、IL-1β含量降低，HFW组IL-1β含量降低 (P＜0.05)，TNF-α含量差异无统计学意义 (P>0.05)；与HF组比较，HFW组BALF中TNF-α、IL-1β含量升高 (P＜0.05)，见表 2。
| 组别 | TNF-α(ng/L) | IL-1β(ng/L) |
| TV组 | 24.3±5.7 | 90.6±14.1 |
| HV组 | 108.4±16.0a | 338.5±44.3a |
| HF组 | 75.6±10.3ab | 188.9±33.8ab |
| HFW组 | 97.5±10.3ac | 246.8±24.6abc |
| 注：与TV组比较，aP＜0.05；与HV组比较，bP＜0.05；与HF组比较，cP＜0.05 | ||
光镜下，TV组大鼠肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺间质无水肿，仅见少量炎症细胞浸润；HV组肺组织结构破坏，肺泡间隔增厚，明显的肺间质出血水肿，周围大量炎性细胞浸润，肺泡腔内可见渗出物和透明膜形成，部分肺泡破裂融合，HF组肺组织损伤程度较HV组轻，肺泡结构尚可，肺间质和肺泡内渗出物明显减少，但仍可见部分肺泡隔增厚，少量炎性细胞浸润；HFW组损伤介于HF和HV之间见图 2。
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| 图 2 各组大鼠肺组织HE染色图片 (×200) Figure 2 HE stains of lung tissue in each group (×200) |
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电镜下，TV组肺组织超微结构基本正常，细胞间连接紧密，Ⅱ型上皮细胞 (AECⅡ) 表面微绒毛排列基本整齐，细胞核和核边界基本正常，线粒体轻度肿胀，部分嗜饿性板层小体 (OMB) 密度下降、轻微空泡化，血管内皮细胞形态结构正常，气血屏障连续，形态结构清晰；HV组肺组织超微结构明显受损，可见凋亡的AECⅡ，核固缩，细胞染色质边聚，微绒毛稀疏，线粒体结构破坏呈空泡状改变，OMB排空，气血屏障结构模糊，水肿增厚，部分肺泡上皮细胞缺损，血管内皮基底膜断裂；HF组线粒体肿胀，其余超微结构较HV组明显改善；HFW组损伤程度介于HV组与HF组之间 (见图 3)。
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| 图 3 各组大鼠肺组织超微结构改变 Figure 3 Ultrastructural changes under electron microscope |
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本研究参照文献[5]设定40 mL/kg潮气量改良建立VILI模型，常规潮气量机械通气4 h后大鼠肺组织未见明显损伤，大潮气量机械通气组大鼠PaO2降低，肺组织W/D值升高，光镜下肺损伤显著，电镜下广泛的上皮细胞破坏导致基底剥蚀裸露且毛细血管内皮细胞间间隔增加，提示大鼠呼吸机相关性肺损伤模型建造成功。
S1P是调节细胞内外多种生物学功能的重要信号分子之一，在细胞增殖及迁移、细胞内钙离子的释放、血管生成和维持血管内皮屏障等许多生理活动中起着重要作用。S1P通过作用于5种G蛋白偶联受体亚型 (S1P受体1-5) 激活复杂的下游信号，在不同细胞中发挥生物学效应，其中S1P 1型受体普遍表达于体内的各种组织，主要结合Gi和G12/13[6]。激活S1P 1型受体可以减轻肺血管通透性，降低炎症诱导的肺渗漏、增强内皮细胞的屏障保护功能发挥作用[7-8]。本研究在大潮气量机械通气组使用非选择性的S1P受体激动剂FTY720，减轻了VILI的损伤程度，而联合应用S1P 1型受体特异性拮抗剂W146时，FTY720对VILI的保护作用明显减弱，提示FTY720至少通过S1P 1型受体发挥了减轻VILI的作用。
研究发现，在大鼠急性肺损伤模型中，通过阻断S1P通路可以抑制肺泡巨噬细胞内NF-kB的激活，减少TNF-α、IL-1β、IL-6的生成，减轻肺组织的损伤[9-10]；在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中，阻断S1P的合成，引起炎症反应加重，可能是与抑制活化蛋白C的抗炎效应有关[11]。本研究观察到，使用S1P受体激动剂FTY720后，VILI大鼠肺组织的炎症反应明显减轻，推测可能通过以上的途径抑制了炎症反应，发挥保护作用。
细胞凋亡在VILI的发病机制中有重要的作用，大潮气量通气肺细胞凋亡指数明显增加，可能由于大潮气量造成气道压的升高，支气管上皮细胞受到牵拉的刺激，同时大潮气量引起BALF中的TNF-α、IL-1β等炎性因子增加，钙稳态失衡，加速了细胞的凋亡，使肺功能受损[12]。本研究观察到，VILI组大鼠肺细胞凋亡率明显增高，与以往的研究结果相符[13]，使用S1P受体激动剂即FTY720后，大鼠肺细胞凋亡明显降低。S1P可能通过激活ERK通路，抑制Bad蛋白的激活，下调凋亡因子Bax的表达，阻止其易位到线粒体，减少细胞色素c的释放，阻止了细胞的凋亡[14]。S1P还可能通过下调P38 MAP kinase的磷酸化水平，减弱caspase-3的激活[15]，逆转Cer的促凋亡作用[16]，发挥抑制肺细胞凋亡的作用，从而减轻了VILI程度，改善肺功能。
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