冠状动脉微栓塞(coronary microembolization, CME)是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes, ACS)患者行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)过程中的常见并发症^[1]。CME可导致心肌无复流或慢血流，引起局部心肌收缩功能障碍，并可导致致死性心律失常，严重影响患者心功能及预后^[2-3]。如何准确评估并有效预防CME的发生是心血管介入医生亟需解决的难题。笔者前期研究发现，CME发生后心肌细胞凋亡是导致心功能受损的主要机制之一，抑制心肌细胞凋亡可以显著改善CME后心功能^[4-5]。

Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)是一种识别病原相关分子模式的受体，其与心血管疾病的相关研究中以TLR4研究最多。研究发现心肌梗死后TLR4激活，心肌细胞凋亡增加，当敲除TLR4基因后，心肌细胞凋亡减少，同时小鼠的存活率增加^[6]。TLR4激活进而诱导心肌细胞凋亡广泛参与包括动脉粥样硬化在内的多种心脑血管疾病的进展^[7-9]。研究发现TLR4同样参与心肌缺血-再灌注损伤所致的细胞凋亡及炎症性损伤^[10-12]。TLR4是否参与CME所致心肌损伤并导致心功能障碍目前还不得而知。因此，本研究拟通过建立大鼠CME模型，检测CME后心肌组织TLR4及核转录因子-κB (NF-κB)表达量的变化，探讨TAK-242调控TLR4/NF-κB信号通路对CME后心功能障碍的影响，为CME的临床防治提供理论依据。

微栓塞球(42 μm)购自美国Biosphere Medical公司；TAK-242购自上海皓元生物医药科技有限公司；TUNEL染色试剂盒购自美国Roche公司；TRIzol、总RNA提取试剂、RT-PCR逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR酶及SYBR GREEN Ⅱ等购自美国Promega公司；小鼠抗大鼠TLR4、NF-κB p65、活化Caspase-3单克隆抗体及内参GAPDH多克隆抗体购自美国Abcam公司；HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自中国KeyGEN公司。

健康成年雄性SD大鼠45只，体质量250~300 g，由广西医科大学实验动物中心提供，本实验经广西医科大学动物实验伦理委员会审核批准。按随机数字表法分为假手术组(n=15)，CME组(n=15)，CME+TAK-242组(n=15)。笔者前期研究^[13]发现CME后心肌细胞凋亡高峰出现在6 h，因此本研究以CME后6 h为观察检测时间点。

参考笔者前期研究^[13]的方法制作SD大鼠CME模型。以先盐酸戊巴比妥(30~40 mg/kg)腹腔内注射诱导麻醉，后经喉气管内插管，小动物呼吸机辅助呼吸。经胸骨左缘第3~5肋间开胸，用血管夹夹闭升主动脉约10 s，同时迅速以微量注射器从左心室心尖部向左心室内注入微栓塞球(100 mL，约3 000个)。心律平稳后逐层关胸，待其自主呼吸恢复后，拔除气管插管。术毕腹腔内注射80万单位青霉素，常规饲养。假手术组以同样的方法向左心室内注入100 mL生理盐水。CME+TAK-242组于微栓塞前30 min经尾静脉注射TAK-242(2 mg/kg)^[14]。

于术后6 h检测各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(FS)、心排血量(CO)和左心室舒张期末径(LVEDd)。超声探头频率为10 MHz。所有测量值均取3个心动周期的平均值。超声心动图检查均由一位经验丰富的专科医生完成。

心功能检测结束后，于大鼠尾静脉注射10%KCl 3 mL，心脏停搏后立即开胸取出心脏，去除心耳及心房，心尖部立即经液氮速冻后移至-80 ℃冰箱保存，用于后续RT-PCR及Western blot检测，心底部经4%多聚甲醛固定12 h后，石蜡包埋并切片，行苏木精-碱性复红-苦味酸(HBFP)染色及TUNEL检测。

用DMR+Q550病理图像分析仪检查，每张HBFP染色切片随机选取5个视野(×100), 使用平面法测量梗死区域(Leica Qwin分析软件)，结果以总分析切片面积百分比表示，取其平均数^[15]。

严格按照试剂盒说明书操作，光镜下凋亡细胞核呈棕黄色(TUNEL阳性)，每张切片分别在微梗死区、梗死边缘区和远离梗死区各取10个(共30个)非重叠400倍光镜视野，计算TUNEL阳性细胞数和心肌细胞总数，心肌细胞凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/心肌细胞总数×100%^[13]。

按照TRIzol操作说明提取细胞总RNA，并用NanoDrop测定其浓度后逆转录合成cDNA。根据荧光定量PCR说明书设置反应体系及参数，每个样本均设置复孔。引物由Takara公司提供，TLR4上游引物: 5’ -AAGTTATTGTGGTGGTGTCTAG-3’，下游引物: 5’ -GAGGTAGGTGTTTCTGCTAAG-3’; GAPDH上游引物: 5’ -TGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物: 5’ -GATGCAGGGATGATGTTC-3’。GAPDH作为内参对照，结果采用2^-ΔΔCT法比较。

按照蛋白提取试剂盒(索莱宝，北京)说明书操作，分别提取心肌组织总蛋白和核蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，内参为GAPDH。各组均取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，然后分别以相应的一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h。抗原抗体复合物用增强化学发光法显示，胶片暗室X线曝光。采用Quantity one软件对结果图像进行吸光度测定，以目的条带与内参GAPDH条带信号强度比值表示心肌组织中TLR4、NF-κB p65(细胞核)及活化Caspase-3的相对表达量。

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

术后6 h心功能结果显示(表 1)，与假手术组比较，CME组和CME+TAK-242组LVEF、FS、CO明显下降, LVEDd明显增大, 差异均有统计学意义(均P＜0.05)；与CME组比较，CME+TAK-242组LVEF、FS、CO明显升高，LVEDd明显减小，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

HBFP染色结果显示，假手术组未见明显微梗死灶，CME组和CME+TAK-242组均可见局灶性分布的多发微梗死灶(图 1)。CME组和CME+TAK-242组梗死面积比分别为(14.65±4.23) %和(8.58±2.12) %，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

A~C分别为假手术组、CME组、CME+TAK-242组；缺血心肌红染，箭头示微梗死灶 图 1 大鼠心肌微梗死灶HBFP染色(×200) Figure 1 HBFP staining of rat myocardial microinfarction (×200)

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TUNEL检测凋亡心肌细胞核呈棕黄色，正常心肌细胞核呈淡蓝色。凋亡细胞主要分布于微梗死区及其边缘区，假手术组在心内膜下偶可见凋亡细胞。假手术组、CME组、CME+TAK-242组心肌细胞凋亡指数分别为(0.19±0.08) %、(3.36±0.63) %、(1.43±0.51) % (图 2)。与假手术组比较，CME组和CME+TAK-242组心肌细胞凋亡指数升高(均P＜0.05)；与CME组比较，CME+TAK-242组心肌细胞凋亡指数下降(P＜0.05)。

与假手术组比较, aP＜0.05；与CME组比较, bP＜0.05 图 2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡(×400) Figure 2 Myocardial apoptosis detected using TUNEL (×400)

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荧光定量PCR结果显示(图 3)，与假手术组比较，CME组、CME+TAK-242组TLR4 mRNA表达量均显著增加，差异均有统计学意义(均P＜0.05)；与CME组比较，CME+TAK-242组TLR4 mRNA表达量显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

与假手术组比较, aP＜0.05；与CME组比较, bP＜0.05 图 3 荧光定量PCR检测TLR4 mRNA相对表达量 Figure 3 Quantitative PCR detected expression of TLR4 mRNA

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Western blot定量分析结果显示，与假手术组比较，CME组、CME+TAK-242组TLR4、NF-κB p65(细胞核)和活化Caspase-3蛋白表达均显著增加，差异均有统计学意义(均P＜0.05)；与CME组比较，CME+TAK-242组TLR4、NF-κB p65(细胞核)和活化Caspase-3蛋白表达均显著减少，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。见图 4~6。

与假手术组比较, aP＜0.05；与CME组比较, bP＜0.05 图 4 Western blot检测TLR4蛋白相对表达量 Figure 4 Western blot detected the levels of TLR4 protein in three groups

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与假手术组比较, aP＜0.05；与CME组比较, bP＜0.05 图 5 Western blot检测细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量 Figure 5 Western blot detected the levels of NF-κB p65(Nuclei) protein

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与假手术组比较, aP＜0.05；与CME组比较, bP＜0.05 图 6 Western blot检测活化Caspase-3蛋白相对表达量 Figure 6 Western blot detected the levels of cleaved Caspase-3 protein

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探索有效防治PCI术中CME的新途径是摆在冠心病介入医师面前的重要挑战。研究发现，CME后局部心肌组织出现微梗死灶，广泛炎症损伤及心肌细胞凋亡、坏死并存，心功能进行性下降^[16]。CME一旦发生，冠状动脉内应用溶栓剂、硝酸甘油、钙离子拮抗剂、血小板GPⅡb/Ⅲa等措施均不能有效改善患者预后^[17]。本研究通过建立大鼠CME动物模型，探讨TAK-242调控TLR4/NF-κB信号通路对大鼠CME后心肌细胞凋亡的影响及意义。

本研究结果发现，大鼠CME发生后TLR4/NF-κB信号通路显著激活，心肌组织中TLR4及NF-κB p65表达明显上调，同时凋亡相关蛋白活化caspase-3明显增加，心肌细胞凋亡指数升高，心功能明显受损。应用TLR4抑制剂TAK-242后，心肌组织中TLR4及NF-κB p65表达下调，心肌细胞凋亡指数下降，同时心功能也明显改善。这提示TAK-242通过调控TLR4/NF-κB信号通路能抑制CME所致心肌细胞凋亡，减少心肌微梗死面积，改善心功能。

细胞凋亡在心功能不全中扮演重要角色，CME后心肌细胞凋亡及炎症反应是导致心功能受损的两大重要病理机制，笔者前期研究已发现抑制心肌细胞凋亡可有效改善CME后心功能损伤^{[5, 15]}。CME发生后心肌收缩功能明显下降，心肌血流灌注却未明显改变甚至有所增加，变现为心肌灌注与收缩不匹配现象。由于心肌细胞为终末期分化不可再生细胞，凋亡所致心肌细胞缺失可能在心肌收缩功能障碍的发生发展过程中发挥关键作用。参与CME后心肌细胞凋亡的调控机制极其复杂，至今仍未完全阐明。

TLR4是一种介导机体固有免疫反应的受体，其在冠心病的发生与进展中发挥关键作用，抑制TLR4激活有望成为冠心病治疗的靶标之一^{[10, 18]}。TLR4同样参与心肌缺血-再灌注损伤，TLR4基因敲除小鼠在心肌缺血-再灌注后，心肌梗死面积较野生型小鼠显著减少，进一步研究发现，TLR4基因敲除或使用拮抗剂可下调缺血-再灌注引起的NF-κB活化，TLR4/NF-κB信号通路的激活与心肌缺血-再灌注损伤密切相关^{[11-12, 19]}。Ishikawa等^[20]研究发现TLR4在急性心肌梗死和稳定性心绞痛等患者破裂的粥样斑块中有所表达；与健康对照者比较，急性心肌梗死和稳定性心绞痛患者TLR4表达水平显著增高。本研究结果同样发现TLR4/NF-κB信号通路可能在CME致心肌损伤中发挥重要作用。

NF-κB是广泛表达于哺乳动物细胞中的重要转录调节因子，参与调控多种基因转录，在机体细胞凋亡调控及炎症免疫应答反应中扮演重要角色。NF-κB通过调控心肌细胞凋亡相关基因的表达，参与多种心脏疾病的发生与发展。NF-κB的激活在TLR4信号通路下游调控凋亡蛋白酶转录与翻译中发挥关键作用^[21]。抑制TLR4介导的NF-κB激活有望成为改善CME后心功能的重要途径。

综上所述，本研究通过构建大鼠CME模型，采用TAK-242抑制TLR4/NF-κB信号通路的传导能够有效改善CME后心功能。本研究结果初步证实TLR4在CME致心功能障碍中扮演重要角色，为下一步以TLR4为治疗靶点的心肌保护研究提供依据，并为PCI术中CME的防治提供新思路。但同时本研究仍存在一些局限性，应用塑料微栓塞球建立CME造模是机械性造成冠状动脉微栓塞，与临床实际动脉粥样硬化斑块破裂形成的富含血小板、红细胞等具有生物活性的微栓子不同，并不能完美模拟临床CME后实际病理生理过程。CME防治是一项复杂系统工程，仍需要大量的动物及临床试验提供理论支持。