2017, Vol. 26
脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，治疗困难，病死率高，其主要致病机制之一是发病过程中感染造成的大量炎症因子过度释放导致的炎症失控和免疫失衡[1-2]。内毒素通过细胞信号转导机制将信号从受体转导到细胞核，激活NF-κB信号通路，启动多种细胞因子基因的转录和翻译，引起机体免疫功能抑制[3-5]。研究表明，应用艾司洛尔治疗严重烧伤儿童，IL-6、IL-1浓度显著降低，炎症反应缓解[6]。可见，β受体阻滞剂对全身炎症反应是有益的，但具体作用机制尚未见报道。有研究证实，在盲肠结扎穿孔术(CLP)导致脓毒症的小鼠模型中，肾上腺素通过蛋白激酶A途径促进巨噬细胞中TNF-α等炎症介质的生成，给予蛋白激酶A抑制物H-89，TNF-α等炎症因子水平则可降低[7]，进一步提示肾上腺素能受体途径可促进炎症因子生成，但具体机制尚不清楚，由此我们可以假设：艾司洛尔可能通过对大鼠巨噬细胞β1肾上腺能受体以及NF-κB信号通路作用，调控下游炎症因子TNF-α表达。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器艾司洛尔(齐鲁制药有限公司，20130614)；脂多糖(美国Sigma公司，120M4017V)；胎牛血清(GIBCO公司，623311)；DMEM培养基(GIBCO公司，1183136)；0.25%胰酶(GIBCO公司，1297729)；兔抗大鼠β1-AR多克隆抗体、兔抗大鼠P65多克隆抗体、兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体均(美国santc cruz公司)；β-action(南京凯基公司)；细胞全蛋白提取试剂盒、核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检查试剂、超敏EC检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)；非放射性EMSA试剂盒(美国Pierce公司); 蛋白Marker(美国Fermentas公司)；垂直式电泳仪(美国BIORAD产品)；胶片(柯达公司)。
1.2 方法 1.2.1 大鼠腹膜巨噬细胞的获取取8~10周SPF级雄性Wistar大鼠(购自南京医科大学实验动物中心)，体质量(220±20) g，10只，颈椎脱落处死，75%乙醇浸泡3 min，取出大鼠，置于无菌纸上，腹面朝上。用镊子提取小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜，消毒腹膜。以5 ml注射器注入5 ml 0.9%氯化钠溶液。针尖朝上避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，按摩腹部3 min，吸出腹腔液。细胞悬液离心200×g 10 min，用0.9%氯化钠溶液洗涤后再离心，用RPMll640液混匀装入锥形瓶中，将获取腹膜巨噬细胞计数，以RPMll640培养液调整密度至3×106~4×106个/ml。
1.2.2 细胞培养及分组在接种细胞的培养瓶内加入无血清RPMll640培养液，青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/L。4 h后待细胞贴壁后用无血清培养液轻轻吹打细胞，将没有贴壁的细胞除去，这样可以使巨噬细胞的纯度达到99%。按实验设计将细胞分为：空白组，用0.9%氯化钠溶液处理；脂多糖组，用10 mg/L脂多糖处理；艾司洛尔加脂多糖组，100 μL/ml脂多糖加艾司洛尔10 μmol/L)共同处理；各组在不同处理因素作用后取上清液和细胞。
1.2.3 Real-time PCR采用一步法Real-time PCR(即反转录和PCR在一个反应体系中)分析各组细胞中各个因子mRNA的水平p65: (sense) 5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′ and (antisense)5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′; TNF-α:(sense)5′AGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAA3′and (antisense) 5′AACACCCATTCCCTTCACAGAGCAAT3′; β1-AR: (sense)5′CT CACCAACCTCTTCATCATG3and (antisense) 5′GAAACGGCGCTCGCAGCTG3′; β-actin: (se nse)5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'and(antisense)5'-AAGGGACTTCCTGTAACAACG CA-3')。所用试剂盒RNA-directTM SYBRGreen Realtime PCRMaster Mix。反应条件为：90 ℃ 30 s、61 ℃ 20 min、95 ℃ 60 s, 接着95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min进行40个循环，最后一个循环后，得到一条55~95 ℃的溶解曲线。每个样品采用3个复孔。
1.2.4 Western blot蛋白浓度测定按照BCA蛋白定量试剂盒说明书操作, 取等量总蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳分离, 将目的蛋白转移至PVDF转膜上, 用5%的脱脂奶粉封闭，TBST冲洗后加入相应的一抗(1: 500) 和辣根过氧化物酶偶联的二抗(1: 5 000), 用超敏ECL化学发光法检测蛋白条带。
1.2.5 非放射性凝胶电泳迟滞分析(EMSA)检测NF-κB活性刺激巨噬细胞6 h后提取核蛋白，按进行Pierce公司提供的说明书进行EMSA测定。
1.3 统计学方法所用数据均采用统计学软件SPSS 16.0进行，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示, 进行成组t检验, 以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 艾司洛尔可抑制脓毒症大鼠腹腔巨噬细胞模型中TNF-α的表达大鼠腹腔巨噬细胞用LPS刺激12 h后(在预实验中发现，TNF-α在12 h时表达最多)，与正常组相比，TNF-α的mRNA及蛋白表达明显增加(P＜0.01)；而与LPS刺激组相比，共同刺激组TNF-α的表达水平明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示艾司洛尔可抑制大鼠巨噬细胞中TNF-α的表达(图 1~2)。
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| 与Control组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 1 qRT-PCR检测各组TNF-αmRNA表达的变化 Figure 1 Effect of TNF-α in each group by qRT-PCR |
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| 与Control组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 2 Western blot检测各组TNF-αmRNA表达的变化 Figure 2 Effect of TNF-α in each group by Western blot |
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大鼠腹腔巨噬细胞用艾司洛尔和LPS刺激12 h后，与正常组比较，LPS刺激组中β1-ARmRNA及蛋白表达明显增多(P＜0.01)，而艾司洛尔组β1-AR的表达明显减少(P＜0.01)；与LPS刺激组比较，共同刺激组中β1-AR的表达明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示艾司洛尔减少β1-AR的表达(图 3~4)。
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| 与Control组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 3 qRT-PCR各组β1-AR mRNA表达的变化 Figure 3 Effect of β1-A Rin each group by qRT-PCR |
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| 与Control组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 4 Western blot检测各组β1-AR mRNA表达的变化 Figure 4 Effect of β1-AR in each group by Western blot |
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大鼠腹腔巨噬细胞巨噬细胞用LPS刺激12 h后，与正常相比，P65 mRNA的表达明显水平明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；而与共同刺激组比，P65的表达明显低于LPS刺激组，(P＜0.05)，提示艾司洛尔可抑制P65的表达(图 5~6)。
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| 与Control组比较, aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 5 qRT-PCR各组P65 mRNA表达的变化 Figure 5 Effect of P65 in each group by qRT-PCR |
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| 与Control组比较, aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 6 western blot检测各组P65表达的变化 Figure 6 Effect of β1-AR in each group by western blot |
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大鼠腹腔巨噬细胞分别用艾司洛尔与LPS按照实验分组刺激6 h(在预实验中发现，NF-κB/DNA结合活性在6 h时表达最多)。在正常组中可以检测NF-κB/DNA结合活性基础值。与正常组相比，LPS刺激组中NF-κB/DNA结合力明显增高(P＜0.01)；而共同刺激组中NF-κB/DNA结合力明显抑制(P＜0.05)；与LPS刺激组相比，艾司洛尔组及共同刺激组中NF-κB/DNA结合力都受到显著抑制，差异有统计学意义(P＜0.01)。由于未标记探针可以与生物素标记探针相竞争，因此结合反应具有特异性(图 7)。
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| 与Control组比较, aP＜0.05，bP＜0.01，与LPS刺激组比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 7 EMSA检测各组NF-κB/DNA结合活性的变化 Figure 7 NFκB/DNA binding activities in each group by EMSA |
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脓毒症(sepsis)是指感染引起的全身炎症反应综合征，其本质是大量细胞因子和炎症介质释放导致的宿主自身免疫性损伤。脓毒症的发病机制十分复杂，其病理生理过程包括：细胞因子风暴、炎症介质瀑布[8-9]。
脓毒症的发生多由炎症级联反应启动，TNF-α是最主要的炎性细胞因子，也是炎症反应的最初启动者[10-11]。当细菌或脂多糖进入机体后，TNF-α在早期即显著增高[12]。本研究发现，在LPS诱导的脓毒症大鼠巨噬细胞模型中TNF-α的表达明显增高，而在受艾司洛尔刺激细胞模型中TNF-α的表达收到明显抑制。因此，笔者推断艾司洛尔对脓毒症大鼠巨噬细胞的保护作用，与对TNF-α的表达的调控有关。
β1肾上腺素能受体阻滞剂通过下调炎症反应、改善心肌顿抑、心肌凋亡等机制改善心脏功能, 已知所有免疫细胞上均存在大量的以β肾上腺素能受体为主的肾上腺素能受体，艾司洛尔有可能通过竞争性地结合位于免疫细胞上膜表面的β1肾上腺素能受体，阻断对免疫细胞的影响而发挥药理作用, 但也不能排除艾司洛尔抑制大鼠巨噬细胞表面β肾上腺素能受体的表达[13-14]。本研究发现，β1受体在LPS诱导大鼠巨噬细胞模型中表达明显增多，而且在艾司洛尔刺激LPS诱导大鼠巨噬细胞中β1受体的表达受到明显抑制，这提示艾司洛尔也可以通过对β1受体表达抑制参与对大鼠巨噬细胞下游因子调控。
TLR4是LPS的受体，当LPS刺激细胞时，LPS-LPS结合蛋白(LBP)复合物与细胞表面CDl4/TLRs受体结合，通过细胞信号转导机制将信号从受体转导到细胞核，激活NF-κB信号通路，启动多种细胞因子基因的转录和翻译，如TNF-α，大量炎症介质释放再次激活其他炎性细胞使炎症信号不断放大，而大量的促炎细胞因子可直接引起机体免疫功能抑制[14]，本研究结果显示，LPS诱导大鼠巨噬细胞NFκB通路的激活，而艾司洛尔刺激LPS诱导大鼠巨噬细胞可抑制NF-κB通路的激活, 抑制NF-κB通路的激活可减轻巨噬细胞在脓毒症环境中引发的炎症反应。由此我们推测，艾司洛尔对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α表达的减少可能通过对β1受体调控作用NF-κB通路实现。
综上所述，本研究提示艾司洛尔通过阻断肾上腺素受体及其抑制其表达对NF-κB复合物形成及其活性产生抑制效应，从而减弱TNF-α的表达, 验证β受体阻滞剂对脓毒症巨噬细胞炎症因子调控机制。
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