随着我国经济生活水平的明显提高，人们的饮食结构发生了显著变化，高脂肪、高热量饮食明显增加，故高脂血症人群数量日益增多。根据流行病学调查研究资料显示，高脂血症性急性胰腺炎发病率逐年增高^[1-2]，且其诱发的急性胰腺炎病理损伤明显，病情更重，病死率更高，故积极寻求有效控制高脂血症性急性胰腺炎的治疗方案已刻不容缓。本研究选用血脂以甘油三脂升高为主的实验动物仓鼠，应用逆行胰胆管注射法增加胰管内压力模拟胰管梗阻、胆汁反流入胰管等急性胰腺炎临床发病因素，诱导建立可靠、稳定的高脂血症性急性胰腺炎动物模型，并通过设立对照组，探讨高脂血症对急性胰腺炎胰腺微循环系统的影响。

购北京维通利华实验有限公司购买30只健康青年雄性仓鼠，体质量100~120 g；3.5%牛磺胆酸钠溶液试剂(美国Sigma公司)，1%戊巴比妥及吖啶橙靶向白细胞染料(上海化学试剂公司)，仓鼠特制高脂饲料(15%猪油，0.2%胆固醇，84.8%基础饲料)及普通饲料均由南通特洛菲饲料科技有限公司提供，Pentax ISC-1000型激光共聚焦显微镜租用于中国科学技术大学生命科学实验中心。

取健康仓鼠30只(每只均有不同的标记)随机(随机数字法)分为2组：血脂正常组(20只)、高脂血症组(10只)，高脂血症组使用高脂饲料喂养，血脂正常组仓鼠使用普通饲料喂养，饲养4周后取所有实验动物静脉血测甘油三酯(TG)含量，并予以肝胆胰超声检查，由血脂正常组筛查10只血脂正常且肝胆胰无病变者，随机均分为正常对照组(C组)和急性胰腺炎组(AP组)，由高脂血症组筛出5只血甘油三酯升高3倍以上且肝胆胰无病变者，作为高脂血症性急性胰腺炎组(HLAP组)。饲养前检测每只仓鼠的血清TG、血清淀粉酶(AMS)，并称质量，记录数据。饲养4周后，检测三组仓鼠的血清TG、血清AMS，称质量，并记录数据。

造模前各组仓鼠均禁食12 h，不禁水，12 h后三组同时按照Schmidt法制作动物模型^[3]，使用1%戊巴比妥纳(0.3 mL/100 g)行腹腔麻醉后，平卧固定，备皮、消毒、铺巾，经上腹部剑突下横行正中切口进腹，切口约2~3 cm，显露出肝下间隙，明确胆总管、胰腺、十二指肠等具体解剖位置。C组仅适当翻动十二指肠与胰腺并进行穿刺操作，但并不注射任何药物(包括生理盐水)。AP组、HLAP组麻醉后，打开腹腔，先找到胆总管，用无创血管夹夹闭远端，然后用尾端连接微量输液泵的4.5号头皮针穿透十二指肠壁由十二指肠乳头处逆行进入胰胆管，随后用微量注射泵将3.5%牛磺胆酸钠溶液恒速(4 mL/h)泵入胰胆管内^[4]，用量1 mL/kg，溶液泵完后，拔出针头，造模完毕。实验过程中为补充有效血容量，维持实验动物模型生命体征平稳，可由仓鼠背部皮下静脉以30 mL/h均速泵入生理盐水(40 mL/kg)。

造模6 h后，下腔静脉内抽取5 mL血检测AMS浓度。向下腔静脉内注入吖啶橙靶向白细胞荧光染料(2 mL/kg)，注射完毕后以激光共聚焦显微镜荧光成像系统动态观察活体动物模型胰腺微循环。固定选取胰头部正中边长为0.5 cm的正方形区域为选定视野，选取吖啶橙染色完成后稳定1 min时间点、放大率100倍的视野图像，应用图像分析系统分别测量所选取视野里各10个微循环毛细血管直径，测量时注意取形态、部位相近的毛细血管，尽量减少偏差，最后求出平均值，即为微循环毛细血管直径(MVD)。应用图像分析系统计算视野内红细胞灌注的毛细血管所占的面积比，最后求出平均值，即为功能性毛细血管密度(FCD)。固定拍摄速度110 fps，回放速度10 fps，回放录像，在监视器上找出目标微血管，采用阴极射线管群点扫描法进行速度测量，调节光点使之与血管平行并顺血流方向连续扫描，调节扫描速度使之与血流速度同步，记录速度值(MFV)。观察后微静脉血管内皮壁上黏附白细胞，白细胞移动缓慢超过30 s的定义为白细胞黏附，以每平方毫米血管壁上黏附白细胞个数计算(个/mm²)。取胰头组织后放入甲醛溶液中保存，即刻送入本院病理科行石蜡固定后制成组织病理切片，于光镜下观察胰腺病理变化，由病理科医师按照Schmidt法进行胰腺组织病理学评分^[5]。

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以用均数±标准差(x±s)表示，饲养前后比较采用自身配对t检验；采用单因素方差分析进行组间比较，组内两两比较方差齐性采用Tukey检验，方差不齐采用Games-Howell检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

对比各组饲养前后数据，HLAP组饲养前后体质量、血清TG变化明显(P < 0.01), 血清AMS变化差异无统计学意义(P>0.05)；AP组、C组饲养前后体质量、血清TG、血清AMS均差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。

对比三组血清TG，HLAP组较AP组和C组显著增高(P＜0.01)；血清AMS浓度，HLAP组和AP组较C组明显增高(P < 0.01)，见表 2。

与AP组、C组比较，HLAP组胰腺微循环功能指标MVD、FCD、MFV明显降低(P < 0.01), 白细胞黏附显著增加(P < 0.01)。C组胰腺微循环系统结构完整，毛细血管壁光滑，功能血管密度均匀，未见白细胞渗出；AP组胰腺微循环系统部分破坏，毛细血管壁可见白细胞黏附，外周可见白细胞渗出，功能血管密度较C组稀疏，部分血管闭塞；HLAP组胰腺微循环系统结构异常紊乱，毛细血管壁大量白细胞黏附，外周白细胞渗出明显，功能血管少见。见表 3、图 1。

A：C组；B：AP组；C：HLAP组 图 1 激光共聚焦显微镜荧光成像系统观察活体动物模型胰腺微循环图像 Figure 1 The pancreatic microcirculation pictures of living animal models under laser confocal microscope fluorescence imaging system

图选项

对比三组的胰腺病理学评分，AP组与HLAP组病理学评分显著高于C组, 而HLAP组病理学评分明显高于AP组(P < 0.05)。C组胰腺组织结构完整，可见散在的胰岛组织，未发现充血坏死；AP组胰腺组织光镜下可见明显腺泡细胞水肿、片状出血坏死，视野中可见以大量中性粒细胞为主的炎症细胞浸润；HLAP组较AP组胰腺坏死情况严重，小叶结构消失，出现凝固样坏死，可见胰腺组织出现广泛的出血，以中性粒细胞为主的炎症细胞较多。见表 2、图 2。

A：C组；B：AP组；C：HLAP组 图 2 各组实验动物胰腺组织病理图(HE×200) Figure 2 The pathplogical pictures of pancrease in three groups(HE×200)

图选项

血清甘油三酯异常升高是急性胰腺炎发生的高危因素^[6]，相关统计数据表明，高甘油三酯血症合并急性胰腺炎发作的患者占高甘油三酯血症患者的30%，根据弗雷德里克森分型，其中1型、4型及5型以高甘油三酯为特点的高脂血症患者发生急性胰腺炎的概率更高^[7]。临床上高脂血症性急性胰腺炎发病率高达12.6%^[8]，并且仍未有任何一种治疗方案可降低其病死率，故进一步研究其发病机制、治疗方法，获得可靠的高脂血症性重症急性胰腺炎实验动物模型尤为重要。目前相关研究已明确AP的发生与血清胆固醇无明显关系^[9]，而血清甘油三酯(TG)升高可诱发急性胰腺炎^[10]。长期以来国内外多选用SD大鼠或Wsitar大鼠作为高脂血症实验造模动物，虽可通过高脂饮食饲养或脂肪乳剂灌胃法诱导成高脂血症实验动物模型，但其血清甘油三酯升高的同时并伴有血清胆固醇的升高，而仓鼠通过不同配比的高脂饲料喂养，可诱导出以血清甘油三酯升高为主的高脂血症实验动物模型^[11]。

相比于其他的造模方式, 本研究所有造模方法的优点在于：(1) 胰腺病理损伤明显。高脂血症性胰腺炎在临床上多表现为以胰腺坏死为主要病理变化, 起病急骤, 进展较为迅速, 病情也较重, 而牛胆酸钠法诱导的急性胰腺炎模型, 其病情进展、病理损伤模式及临床情况几乎与其一致。(2) 损伤情况较为稳定。逆行胰胆管注射法仅于大鼠上腹部取横行小切口进入腹腔，明确十二指肠、胆总管的解剖位置后，由头皮针穿过十二指肠大乳头逆行进入胰胆管。此法创伤小，易于操作，相较于十二指肠切开胰胆管注射法，此法避免了肠梗阻、液体丢失过多、肠瘘及肠蠕动功能减退等情况的发生；利用微量输液泵匀速地向胆胰管泵入牛磺胆酸钠溶液，可同时保证操作上的重复性及稳定性。

本实验选用仓鼠为实验动物，结合目前较为科学的逆行胰胆管注射法，成功建立出可靠、稳定的高脂血症性急性胰腺炎动物模型，可用于后期的高脂血症性急性胰腺炎的相关研究。

虽然目前HLAP的发病机制尚不完全清楚，普遍认可的发病机制是游离脂肪酸(FFA)学说^[12]。而且最新的高脂血症性急性胰腺炎相关研究还发现，血脂增高时血浆浓稠度增高，血液自身阻力增大，血流速度减慢，血液淤积于胰腺微循环内，致使胰腺组织缺血、缺氧^[13]，毛细血管壁通透性增加，而且血脂明显增高时，毛细血管壁内皮细胞吞噬脂质颗粒，发生脂质过氧化，内皮细胞结构受损^[14]，胰腺微循环系统发生表型改变，而且这种微循环的表型改变远远早于大动脉的脂质条纹损伤的出现，如同时合并有外界因素如酒精、胰腺外力创伤、胆汁逆行流入胰管等，将并发急性胰腺炎，且其胰腺病理损伤较单因素胰腺炎更加严重^[15]。另外有研究表明高脂血症可刺激肝脏合成纤维蛋白原(FIB)，使血小板的聚集性增强，促进凝血过程，使微血管微血栓形成风险增高，而且高血脂其自身也可增加血液黏滞度，致使红细胞膜脂质过氧化，促使红细胞聚集，减弱其变形能力，形成微血栓，以至于胰腺组织内血流速度减缓、胰腺毛细血管微循环血液淤积，导致胰腺毛细血管壁内皮细胞超微结构受损，也是微循环功能不全的主要原因之一^[16]。而且相关研究发现高脂血症的小鼠血液中免疫细胞比例失调，免疫细胞表型的表达发生改变及血浆中MCP-1、IL-6等炎性细胞因子明显升高，这些非正常性改变表明高脂血症可引起天然免疫异常，促使白细胞聚集、黏附，损伤微循环系统，致使微循环功能不全，同时由于胰腺腺叶组织无侧枝循环的解剖学特性，致使其微循环对缺血、缺氧异常敏感^[17]。

尽管高脂血症引起胰腺微循环障碍学说由来已久，但对活体胰腺微循环系统进行直接观察的报道极少，本实验利用激光共聚焦显微镜荧光成像技术动态观察活体动物模型胰腺微循环系统，发现HLAP胰腺微循环较AP胰腺微循环系统损伤明显，胰腺病理损伤评分更高，故证实了上述假说，也为临床应用低分子肝素改善HLAP胰腺微循环提供实验依据。