随着科技地进步，细菌的鉴定方法不断改进，从最初地通过细菌形态、染色、抗原、生化和血清学等方法对细菌进行鉴定到后续的分子生物学方法，以及近些年来快速发展的质谱技术，使得临床微生物检验有了革命性的发展^[1-2]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)具有快速、准确、高通量、操作简单等优点，不仅可准确鉴定临床细菌和酵母菌，还可用于分枝杆菌、丝状真菌的鉴定^[3-4]，微生物分类学和流行病学的研究^[5-6]，直接样本的快速检测以及细菌耐药方面的研究^[7]。

目前商品化质谱主要包括Biotyper MS (BrukerDaltonics, Bremen, Germany)与Vitek MS (bioMérieux, Marcy-l’ Etoile, France)。而国内临床质谱仪的自主研发生产逐渐成熟，并且开始走进临床实验室。国产Clin-TOF质谱仪（毅新博创，北京，中国）已通过SFDA，FDA认证，可用于临床病原微生物的鉴定。目前Clin-TOF系统的研究多局限于生物标志物及特定菌种的研究^[8-9]，用于临床细菌的鉴定还未有系统的评价。本研究旨在使用Clin-TOF系统对临床病原菌进行鉴定，评价其性能，使得国产质谱仪更好地在临床应用和推广。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

收集2015年12月至2016年12月浙江大学医学院附属第二医院临床分离非重复菌株1259株，样本种类包括：血液、痰液、脑脊液、分泌物和尿液等。

1.1.2 试剂与仪器

Vitek2 compact细菌鉴定系统和药敏系统(BioM6rieux公司，里昂，法国)；Clin-TOF基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Clin-TOF MS) (北京毅新博创生物科技有限公司，北京，中国)；PCR扩增仪及紫外成像系统(德国Biometra公司，耶拿，德国)；DYY-1l型电泳仪(北京市六一仪器厂，北京，中国)；PCR反应试剂盒[(宝生物工程(大连)有限公司，大连，中国)]；细菌和真菌基因组DNA小量质粒抽提试剂盒[(爱思进生物技术（杭州）有限公司，杭州，中国)]；Clin-TOF MS专用试剂盒(北京毅新博创生物科技有限公司，北京，中国)。

1.2 方法 1.2.1 菌种分离鉴定

临床常规细菌分离鉴定采用Vitek-2 Compact全自动细菌鉴定仪，对于只能鉴定到复合群或未给出结果以及疑似鉴定不准确细菌，进行PCR扩增。常规细菌采用16S rRNA，不动杆菌复合群采用16S-23S rRNA，洋葱伯克霍尔德菌采用hisA，酵母菌采用ITS分别扩增，引物序列及条件按照文献报道^[10-12]。PCR产物送至上海生物工程股份有限公司，测序结果与基因文库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，确定菌种。

1.2.2 质谱鉴定

采用直接涂布法将细菌单菌落均匀涂布于Clin-TOF专用靶板（384孔）上，干燥后加1 μL飞行时间质谱系统微生物前处理试剂盒组分Ⅰ，干燥后再添加1 μL组分Ⅱ（使用前震荡混匀），室温干燥后使用Clin-TOF质谱仪进行检测。在线性模式下设置如下参数：激光频率20 Hz、加速电压20 kV、脉冲电压1.9 kV、离子透镜电压5 kV、相对分子质量范围2 000~13 000。将质谱图导入BioExplorer V2.0软件数据库，生成鉴定报告。

2 结果 2.1 鉴定结果

本次研究收集到1 259株临床菌株覆盖134个种，主要包括非发酵菌，肠杆菌科细菌，葡萄球菌，肠球菌，链球菌，棒状杆菌，芽孢杆菌，奴卡菌，放线菌，奈瑟氏菌，厌氧菌，酵母菌以及其他临床细菌，Clin-TOF质谱对这1 259株临床细菌的属水平鉴定准确率为97.06% (1 222/1 259），种水平（包括鉴定到复合群）鉴定准确率为96.67% (1 217/1 259)，其中对84种的细菌都能准确鉴定，包括临床常见葡萄球菌（85株），肠球菌（57株），念珠菌（62株）鉴定准确率均为100%。对21种肠杆菌科细菌（407株），除枸橼酸杆菌外，其他细菌均鉴定准确，种水平鉴定准确率为98.7%（400/407）。对13种链球菌种水平鉴定准确率为98.04%（100/102），属水平鉴定率100%，见表 1。

2.2 复合群菌种和属水平鉴定

本次研究选取菌株中包括临床常见复合群中细菌，通过生化方法，16S rRNA、16S-23S rRNA、hisA等基因扩增方法鉴定到种水平，Clin-TOF将144株细菌鉴定到各自所在复合群，包括阴沟肠杆菌复合群、缓症链球菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鲍曼不动杆菌复合群、产吲哚/黏金黄杆菌复合群、豚鼠/嗜水/简氏气单胞复合群、木糖氧化无色杆菌复合群、无枝菌酸棒杆菌/干瘪棒杆菌以及腐败希瓦菌/海藻希瓦菌复合群。

5株细菌鉴定到属水平（1株卡他莫拉菌，2株灰色奈瑟氏菌，1株肺炎链球菌，1株婴儿链球菌）。

2.3 错误鉴定和无鉴定结果

鉴定错误的细菌比例为1.08%（14/1 259），无鉴定结果比例为1.83%（23/1 259），表 1。

3 讨论

MALDI-TOF MS具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等特点，已成为一项高效的微生物快速鉴定技术，被用于全球的临床微生物实验室，并有望逐步取代常规的检测方法。目前在中国大陆临床广为推广的两种质谱系统（Biotyper MS和Vitek MS）已经非常成熟，其对临床常见的细菌鉴定结果准确率都达到了95%以上^[1-2]。鉴于质谱仪在病原菌鉴定上的优势，近两年出现了包括Clin-TOF在内的国产质谱仪，本研究针对临床常见的病原菌采用Clin-TOF进行鉴定并评估该仪器的性能。结果显示对于1 259株临床菌株（134个种），Clin-TOF鉴定到种水平准确率可达96.67%，属水平准确率为97.06%，显示Clin-TOF质谱用于临床细菌鉴定的性能十分优异，有文献报道用Biotyper MS对1 660株临床分离菌株（109个菌种）进行检测，并通过16S rRNA和rpoB基因测序确定^[13]。结果显示属的鉴定水平达95%，种的鉴定水平在84%以上。而Vitek MS鉴定了767株常规临床分离株（124个种），同样采用直接涂布的方法，种水平准确率为86.7%，属水平准确率96.2%^[14]，从鉴定结果显示Clin-TOF在常规菌株的鉴定上完全不亚于BiotyperMS和Vitek MS。范欣等对Clin-TOF MS鉴定于革兰阴性菌的能力进行了评价，结果显示Clin-TOF MS对阴性杆菌的鉴定准确率高达98.05%^[15]，略高于本研究的鉴定准确率，这可能与所选菌种类别有关。并且值得一提的是Clin-TOF质谱具有一次同时鉴定384个样本的高通量靶板，且可重复使用，对临床样本量大的实验室具有更大的优势。

Clin-TOF质谱在酵母菌的鉴定上有一定的特色。目前真菌的鉴定方法主要包括显微镜形态学和生化反应以及DNA为基础的分子技术，如18S rRNA基因、内转录间隔区（ITS）DNA测序和实时PCR测定。文献报道采用质谱技术对真菌进行鉴定准确性不如细菌，102株酵母菌（14个不同种）分别采用Vitek MS和BioTyper MS进行检测，鉴定准确的酵母菌（准确率）分别为81个(79%)和92个(90%)^[16]。目前尚无报道Clin-TOF MS对真菌鉴定能力的评估，而本次试验仅仅鉴定了62株临床分离的酵母菌，且多为念珠菌，Clin-TOF鉴定准确率为100%，因此有待以后采用更多的菌种和菌株进行评估。

临床上有一些较为常见但不易区分的细菌复合群主要包括醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合群、阴沟/霍氏肠杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、弗劳地枸橼酸杆菌复合群、缓症链球菌复合群等，这些复合群菌株基因型和表型非常相似，通常采用常规生化反应、全自动细菌鉴定和药敏系统以及16S rRNA都较难区分。虽然MALDI-TOF MS是利用细菌特征性蛋白进行区分，若细菌蛋白图谱太过相似也会无法区分，如链球菌属细菌中亲缘关系比较相近的唾液链球菌、口腔链球菌和缓症链球菌等^[17]，Clin-TOF对这类链球菌属的鉴定同样也将其分到缓症链球菌复合群中，因此本次试验将鉴定到复合群细菌认为准确鉴定到种。虽然Clin-TOF质谱数据库涵盖枸橼酸杆菌复合群中不同的菌种，主要包括：弗劳地枸橼酸杆菌、杨氏枸椽酸杆菌、布氏枸椽酸盐杆菌、沃克马尼枸椽酸盐杆菌、赛德拉克枸橼酸杆菌等。但从结果来看，还存在一定缺陷，本次研究中22株弗劳地枸橼酸杆菌中5株鉴定错误，其中4株鉴定为布氏枸橼酸杆菌，1株鉴定为杨氏枸橼酸杆菌；7株布氏枸橼酸杆菌中5株鉴定为弗劳地枸橼酸杆菌。因此Clin-TOF在具体细分复合群上还需要进一步优化数据库，若直接鉴定常见复合群中细菌还应辅以其他的方法对结果加以验证。

本次未给出鉴定结果的23株细菌主要为临床少见细菌，还包括一些环境菌，如根癌土壤杆菌、龋齿放线菌，奴卡菌属，这类细菌目前Clin-TOF数据库中还未包含，因此无鉴定结果，可进一步对数据库进行建库补充，以完善数据库提高这类细菌的鉴定准确率。随着质谱技术在国内的迅速发展，质谱的国产化也是非常重要的一个环节。对临床微生物实验室来说，需要建立MALDI-TOF MS的规范化使用，提升微生物鉴定的整体水平，最终更好的服务于临床。