急性百草枯(paraquat，PQ)中毒病死率极高，目前研究认为其发病机制包括氧化应激和免疫激活，导致细胞坏死/凋亡^[1]，而外周血CD4⁺T淋巴细胞在T细胞活化信号的传导和免疫激活中起重要作用。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是机体对外来刺激的应激性反应^[2]，在炎性反应及氧化应激中起重要作用^[3]。正常状态情况下激活转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)及免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein, Bip)、不存在生物学活性，在ERS时具有转录激活物的活性，介导细胞凋亡^[4]。本研究通过检测PQ中毒患儿外周血CD4⁺T淋巴细胞ATF6、GRP78及Bip mRNA水平变化，探讨CD4⁺T淋巴细胞ERS ATF6通路在PQ中毒中的作用，为治疗提供依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

回顾性横断面调查2015年7月至2017年6月就诊于天津市儿童医院的PQ中毒患儿30例，男16例，女14例，年龄2~12岁，纳入标准为主诉有明确PQ接触史，胃内容物、血液及尿液中检出PQ明确诊断，排除合并其他药物中毒及中毒前有其他基础疾病，PQ中毒患儿均为口服中毒，接触PQ后2~22 h就诊，同时选取天津市儿童医院同期体检的健康儿童30例为对照组, 男16例，女14例，年龄2~12岁。常规查体，记录患儿性别，年龄，现病史，胃内容物、血液及尿毒物分析结果。对照组与PQ组性别(对照组男16例，女14例，PQ组男16例，女14例)和年龄(对照组6.60±3.08岁，PQ组4.43±2.28岁)差异均无统计学意义，具有可比性。受试者知情同意且获得伦理委员会的批准。1.2研究方法

1.2 研究方法 1.2.1 诊治方法

确诊患儿均以迈瑞PM-9000便携式多参数监护仪予生命体征监测、以迈瑞(Mindray)全自动五分类血液分析仪BC-5140行血常规、以优利特(Urit)全自动生化分析仪8020A行电解质、肝肾功能、心肌损伤标志物、雷度(Radiometer)ABL80血气分析仪行血气分析等相关检查，并予心电图、超声心动图监测心脏损害，CT监测肺纤维化的发生。紫外分光光度法测定患儿胃内容物、血液PQ浓度。具体方法为留取血清，经10%高氯酸甲醇沉淀血清蛋白，充分震荡。-20℃冰箱放置10 min，12 000 r/min高速离心，取上清液，用50 µL微量比色池以紫外分光光度法测定PQ浓度。予洗胃、导泻清除毒物，使用吸附剂，拮抗肺对PQ的摄取，清除氧自由基，抗氧化，维持内环境稳定，对症支持治疗，保护胃肠黏膜，保肝，利尿，甲泼尼龙抑制炎性反应，乌司他丁减少炎性因子，血液净化治疗，必要时吸氧或使用呼吸机机械通气。

1.2.2 分离外周血CD4⁺T淋巴细胞

PQ组于接触毒物后2~22 h采集外周静脉血标本，同时留取健康对照组外周静脉血标本。无菌采取乙二胺四乙酸二钠盐抗凝静脉血，聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法(北京索莱宝科技有限公司，批号：P8610)分离外周血单个核细胞。按试剂盒(Invitrogen Technologies Inc，USA，批号：15596-06)说明，采用免疫磁珠分离外周血CD4⁺T淋巴细胞，锥虫蓝染色判定细胞活力 > 95%，流式细胞术检测细胞纯度 > 97%，备用。

1.2.3 ATF6、GRP78及Bip mRNA水平测定

取已分离外周血CD4⁺T淋巴细胞，Trizol(北京天根生化科技有限公司，批号：DP405-02)法提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，吸光度260/280比值判定纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照反转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司，批号：ER104-04)合成cDNA后，进行PCR扩增。内参照肌动蛋白(β-actin)与目的片段ATF6、GRP78及Bip的引物应用Gene Runner软件，并根据GenBank发布的目的基因序列自行设计，同时经NCBI BLAST检索无显著同源性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列和扩增产物片段长度见表 1。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction，real-time PCR)法测定mRNA水平，Real-time PCR反应体系参照SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒(北京天根生化科技有限公司，批号：FP202-02)说明书。PCR循环参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸34 s，40个循环。温度变化速度为3 ℃/s，在延伸阶段检测荧光信号，进行实时监控，最后进入解链阶段，绘制产物的融解曲线，以了解样品扩增的特异性，保证测定结果的准确可靠。数据的收集由ABI 7500定量PCR仪自带软件完成。Real-time PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，用GelDoc凝胶成像分析仪扫描电泳结果，根据产物相对分子质量大小来进一步鉴定产物特异性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，数据以(x±s)及95%可信区间表示，两组间比较采用成组t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 临床表现

30例患儿均有口腔黏膜糜烂溃疡、恶心、呕吐、腹痛等消化道症状，头痛、头晕15例，抽搐9例，胸闷憋气呼吸困难12例，消化道出血16例，黄疸6例，少尿、无尿19例。

2.2 实验室检查

就诊时患儿血液中检出PQ浓度为1.6~3.1 mg/L，血常规白细胞(12.56±3.81)×10⁹/L，血肌酸激酶(568.45±125.89)U/L，血肌酐(359.43±90.14)μmol/L，血尿素氮(25.52±6.85)mmol/L，血丙氨酸氨基转移酶(452.76±154.21)U/L。肝功能异常16例(53.33%)，肾功能异常19例(63.33%)，心脏损害14例(46.67%)，急性呼吸窘迫综合征5例(16.67%)。

2.3 转归

存活27例，出院时肝功能异常16例中恢复正常8例，肾功能异常19例中恢复正常11例，心脏损害14例中恢复正常8例。

2.4 Real-time PCR产物琼脂糖凝胶电泳

产物位于预期位置，进一步确定产物特异性，见图 1。

2.5 ATF6、GRP78及Bip mRNA相对表达水平比较

对照组与PQ组ATF6、GRP78及Bip mRNA相对表达水平差异均有统计学意义(t=17.33、24.82、24.20，均P < 0.01)，见表 2。

3 讨论

PQ中毒早期主要症状为多脏器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)^[5]，其机制尚不明确，近年研究表明与氧化应激、免疫激活和炎性介质有关^[6]，导致细胞坏死/凋亡^[7]，引起MOF。而CD4⁺T淋巴细胞在免疫激活和炎性介质的改变中起重要作用。

内质网是新合成的多肽链折叠成熟的场所。不同生理及病理因素阻碍新合成多肽链的折叠成熟，致大量未折叠和错误折叠蛋白在内质网聚集^[8]，为应对这种紊乱，产生一系列的应激反应，统称为ERS^[9]，包括未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)、内质网超负荷反应和固醇调节级联反应等，其中UPR通过ATF6、肌醇需求酶1和双链依赖的蛋白激酶R样内质网激酶介导^[10]，抑制蛋白翻译，增强蛋白折叠能力，促进蛋白外输和降解等方面的作用降低未折叠蛋白浓度，恢复内质网稳态，发挥保护作用^[11]，刺激过强或过久则会发生细胞损伤及炎性反应^[12]。

ATF6的氮末端含有转录激活结构域，位于胞质内，参与多个信号传导系统; 碳末端具有响应应激反应的结构域，存在高尔基体定位信号结合位点及GRP78和Bip结合位点^[12]; GRP78可与错误折叠的蛋白结合，激活参与UPR的信号蛋白的活性，参与蛋白质的正确折叠，降解错误折叠的蛋白质^[13]; Bip位于内质网腔中，正常情况下与ATF6碳末端结合使其失活，正调控对白介素-1及肿瘤坏死因子的反应，参与信号转导^[14]。正常情况下ATF6与GRP78/Bip结合，停留在内质网上，不存在生物学活性; ERS时ATF6与其解离，转移到高尔基体被激活后进入细胞核，上调GRP78及与蛋白质折叠相关的各类结合蛋白和酶的表达，应对不良微环境^[15]。

PQ可致氧化还原失衡，因此推测可能通过使内质网处于应激状态，导致细胞凋亡，并且PQ可能通过CD4⁺T淋巴细胞的氧化应激和(或)凋亡，影响其在信号传导中的作用，从而在MOF起重要作用。本研究初步探讨PQ中毒外周血CD4⁺T淋巴细胞ATF6、GRP78及Bip水平的变化，分析与其可能的在信号传导中的作用，探讨其机制。

本研究证实，PQ中毒患儿CD4⁺T淋巴细胞ATF6、GRP78及Bip表达水平明显升高，这意味着大量CD4⁺T淋巴细胞发生坏死/凋亡。如果凋亡的CD4⁺T淋巴细胞未能及时被吞噬，膜崩解，内容物溢出，引起局部的炎性反应造成组织损伤; 核物质可导致自身抗体和抗核抗体的产生; 核小体与血管内膜结合，成为炎性反应的靶抗原所在部位，参与PQ所致MOF的发生发展^[16]。

PQ所致MOF即使通过积极治疗仍效果欠佳，与大量CD4⁺T淋巴细胞的凋亡、过度而不受控制的炎性反应有关。近年来促进炎症消退已成为治疗MOF的新策略，对氧化应激CD4⁺T淋巴细胞凋亡的调节，进而调控其在免疫激活和炎性反应的作用，将有可能成为MOF防治的有效手段。

综上所述，本研究初步证实PQ可致患儿外周血CD4⁺T淋巴细胞ATF6、GRP78及Bip水平改变，此变化可能是PQ致MOF的机制之一，本研究将有助于进一步探索PQ所致MOF的机制研究，为其治疗提供依据。