心力衰竭猝死机制的研究一直为该领域的学者所关注，超过50%的心源性猝死是由于恶性心律失常所致^[1]。钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca²⁺/calmodulin dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ)可以通过影响细胞内兰尼碱受体、钙泵和受磷蛋白等钙转运蛋白，引发钙稳态失调^[2-5]。研究发现，炎症反应、RAAS系统和交感神经系统等神经内分泌系统可以激活CaMKⅡ通路，导致钙稳态失调，引起潜在恶性心律失常的发生^[6-8]。然而，CaMKⅡ通路在心衰时心律失常的发生发展过程中的作用尚未完全明确。本文利用CaMKⅡ抑制剂KN93，观察其对兔心衰模型迟后除极(delayed afterdepolarization, DAD)和触发活动(trigger activity, TA)的作用及可能的分子机制进行研究，以探索CaMKⅡ在心衰时心律失常发生发展中的作用。

HEPES、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶、FBS胎牛血清、L-谷氨酸、K-aspartame acid、GTP、CdCl₂、TTX和CsCl购自美国Sigma公司; EGTA购自美国Fluka Biochemika公司; DMEM细胞培养基购自美国Thermo公司产品; Lipofectamine转染试剂为美国Invitrogen公司产品。

细胞分离液成份(mmol/L)：NaCl 11.0，KCl 5，CaCl₂ 1.5，MgCl₂ 1.2，HEPES 10，葡萄糖10，pH值用NaOH调至7.4;无钙分离液为分离液中不加CaCl₂但增加EGTA 10 mmol/L。

细胞外液：同细胞分离液。于细胞外液加入4-AP 5 mmol/L阻断I_to，TTX 100 μmol/L阻断I_Na。细胞内液(mmol/L)：CsCl 100、TEA-Cl 20、EGTA 10、Na2ATP 5、HEPES 10，pH调至7.2。

取雄性新西兰大白兔(解放军总医院动物实验中心)，体质量2.5~3.5 kg。采用20%乌拉坦(1.00 mg/kg)麻醉，分离腹主动脉近心端，在右肾动脉开口以上，用丝线将其缩窄60%~70%。2周后钝性分离右侧颈总动脉，4 F动脉鞘管通过右颈总动脉刺破主动脉瓣造成返流，脉压增加50%以上视为手术成功。青霉素肌注连续3 d，预防感染。术后8周评估心功能，心脏射血分数小于50%以下兔允许进入下列实验^[9]。将实验兔随机(随机数字法)分为3组：假手术组(sham组)、心衰组(HF组)、心衰+KN93组(HF+KN93组)，每组10只。其中HF组、HF+KN93组采用腹主动脉缩窄联合主动脉瓣反流术建立兔心力衰竭模型，sham组只游离腹主动脉不缩窄、只结扎右颈总动脉不破坏主动脉瓣。

按文献[10]采用酶解法制备心室肌单细胞并进行了改进。取上述实验兔首先肝素化(腹腔注射100 U/mL)，再用20%乌拉坦(1.00 mg/kg)麻醉，迅速取心脏，在37℃和通氧条件下行Langendorff灌流。用无Ca²⁺ Tyrode's液灌流3~5 min，用含Ⅱ型胶原酶70 mg、胰蛋白酶12 mg的无Ca²⁺ Tyrode's液灌流(50 mL) 25~30 min。沿房室间沟取心室肌，剪碎入KB液中并吹打使细胞脱落，并于-4℃保存，1 h后进行实验。取保存液加入1 mL灌流槽中，待细胞贴壁后，于倒置显微镜下选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩的细胞，37℃下进行实验。Sham组和HF组心肌细胞灌流正常台氏液; HF+KN93组为含有KN93的台氏液灌流心衰心肌细胞，每组取10~15个心肌细胞。

采用全细胞膜片钳记录方法，在电压钳制下记录电流。将Axon-700B膜片钳放大器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)同计算机连接。刺激信号及电压输入信号的采集应用Digidata 1440A数模转换器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)，均由软件(pCLAMP10.2)控制。GG-17玻璃毛坯经pp-83微电极拉制仪(Narishige Co. Japan)拉制成电阻为2.0~5.5MΩ的电极。调节三维操纵器进行封接，使封接电阻达1GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。测定电容时，施以0.4 V/s的斜坡刺激，测电流并按方程Cm=I/(dv/dt)计算(Cm为膜电容，I为电流值，dV/dt即电压斜率)。为消除细胞间的误差，I值以电流密度(pA/pF)表示。信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器滤波，采样率为5 kHz。串联电阻补偿90%~95%以消除电压偏差，液接电位补偿校正至小于2 mV，慢电容补偿约为85%~90 %，以消除膜电容的充放电影响。

动作电位(action potetial，AP)的记录：电流钳模式下，钳制电位为0 mV，1500 pA持续10 ms的20个串刺激，频率为4.0 Hz，记录AP。参照文献^[9] DAD被定义为：在4期紧接着正常动作电位后出现的去极化幅值大于5 ms持续时间大于10ms的自动去极化波形。TA被定义为：在DAD的基础上出现的一个自发性动作电位，其特征是0相有明显的自发性除极。

I_ti电流记录：参照文献^[11]在电压钳方式下，首先给予20个方波预刺激，从-80 ~ +50 mV，150 ms，每组刺激间隔100 ms，之后给予2 000 ms，-100 ~ +30 mV的测试刺激，引出I_ti。I_ti被定义为：波峰与电流基线之间的差值，按第一个出现的波形进行分析。

采用IonOptix离子浓度测定系统检测细胞内钙瞬变。将心肌细胞置于倒置显微镜载物台上的细胞灌流小室内，并给予电场刺激(0.5 Hz，5 ms)，细胞收缩影像通过40×物镜呈现在监视器上，心肌细胞内与游离Ca²⁺结合的荧光物质被激发，并通过双激发荧光光电倍增系统检测荧光信号。单个心肌细胞电刺激钙瞬变测量，刺激状态稳定，0.5 Hz。

取100 mg冻存心肌组织，加入1 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液中。剪碎，高速匀浆; 冰上静置1.0 min; 12 000 r/min，4℃离心1.0 min，取上清液于离心管中，-20℃冻存备用。采用美国Pierce公司生产的蛋白浓度试剂盒，BCA方法测定蛋白浓度。以上样蛋白量20 μg为1次上样量，根据测定的蛋白浓度计算蛋白上样量。采用Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus和NuPAGE 3%~8% Tris-Acetate凝胶，电泳分离NCX1.1、CaMKⅡ、RyR2、PLN，采用Blot Gel Transfer System转移电泳胶将电泳后蛋白从凝胶转移NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃加anti-NCX1.1、anti-CAMKⅡ、anti-RyR2、anti-PLN、anti-pPLN一抗过夜(目的蛋白抗体稀释比例1：200;GAPDH：1:1 000)。次日TBST洗3次，每次10 min。然后用二抗：CaM(1:2 000);GAPDH (1:5 000)室温孵育摇床1 h，用TBST洗3次，每次10 min。ECL发光显影。用ImageLab软件读取条带的积分灰度值。

所有数据以均数±标准差(x±s)表示，数据采用pCLAMP10.2处理，采用spss17.0软件进行统计学分析，多组间数据比较用ANOVA方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

在心衰兔的心室肌细胞上约有73.3% (11/15)出现DAD，进一步约28.6%(4/15)的细胞形成TA与Sham组比差异有统计学意义(P < 0.01);而Sham组仅20%(3/15)细胞出现DAD，未出现TA。应用1.0μmol/L的KN93后，心衰心室肌细胞约46.7%(7/15)出现DAD，其中13.3%(2/15)出现TA，与HF组比差异有统计学意义(P < 0.01)。提示KN93对心衰兔的心室肌细胞DAD和TA均有抑制效应，见图 1。

A.三组细胞DADs及TA的原始记录图; B.三组细胞DADs及TA的发生百分比。与假手术组比较，aP < 0.01，与心衰组比较，bP < 0.01 图 1 KN93对心衰兔心室肌细胞DADs和DAD诱导TA的作用 Figure 1 Effect of KN93 on DADs, DAD-induced TA of ventricular myocytes in rabbit with heart failure

图选项

Iti电流密度在心衰后增加，-50 mV时，峰电流密度从Sham组细胞的-0.12±0.02 pA/pF增加至-0.95±0.06 pA/pF(n=10，P < 0.01)。暴露于1.0 μmol/L KN93后，电流密度降低为-0.44±0.04 pA/pF(n=10，P < 0.01)。I-V显示Iti电流在-50 mV去极化时最大，而在更负或更正的刺激电位时，电流幅值均减少。心衰时，电流密度增加，尤其以-90 ~ +10 mV的电流为甚，且在+20 mV以上电位时出现外向电流。上述现象在应用1.0 μmol/L KN93后得以阻滞，见图 2。

A.给予从-100 mV到+ 30 mV，2000 ms的条件刺激，之后跟着一个从-80到+50 mV，150 ms的测试刺激记录Iti电流; B.心衰后增加的Iti密度可以被KN93抑制; C.显示三组I-V曲线。与假手术组比较，aP < 0.01，与心衰组比较，bP < 0.01 图 2 KN93对心衰兔心室肌细胞Iti的作用 Figure 2 Effect of KN93 on Iti of ventricular myocytes in rabbit with Heart failure

图选项

心衰时，静息态钙浓度、钙瞬变幅度和胞内钙最高50%时间等参数显著升高，与Sham组比差异具有统计学意义(n=15, P < 0.01)。应用1.0 μmol/L KN93后，上述参数的增加幅度均降低(n=15, P < 0.05或P < 0.01)。心衰后兔心室肌细胞内钙瞬变衰减率下降，应用KN93后，得到部分恢复(n=15, P < 0.05)见表 1、图 3。

心衰细胞的钙瞬变幅值显著增加，但可以被KN93抑制 图 3 KN93对心衰兔心室肌细胞内钙瞬变的作用 Figure 3 Effect of KN93 on intracellular calcium transients in the ventricular myocytes of heart failure

图选项

图 4为Sham组、HF组和HF+KN93组主要钙运载蛋白的表达。结果显示，NCX1.1和CaMKⅡ在心衰时表达上调，SERCA2a和pPLN则下调，RyR2和PLN表达基本不变，提示心衰时主要是钙离子摄取障碍，导致细胞内钙离子浓度增加; 提示由于NCX上调，使得I_ti幅值和电流密度增加明显。KN93可以上调pPLN，使其对SERCA2a的抑制降低，同时上调SERCA2a，最终增加钙离子摄取，缓解心衰时钙循环的病理改变。

A.三组细胞钙循环相关蛋白的表达; B.其中心衰组NCX1.1和CaMKⅡ上调，而SERCA2a和pPLN下调，此变化可以被KN93抑制。与假手术组比较aP < 0.05, bP < 0.01;与心衰组比较cP < 0.05, dP < 0.01 图 4 KN93对心衰兔心室肌钙转运蛋白的作用 Figure 4 Effect of KN93 on the cardiac calcium transporter in the ventricular myocytes of heart failure

图选项

心衰时，长期的病理学因素、神经内分泌的过度激活、机械电反馈作用等引起心肌电活动出现多种形式的适应性改变，这些改变在一定程度上能代偿和缓解心功能损害，但同时这种适应性改变将成为新的致心律失常因素，是心衰致心律失常发生的重要原因^[12-13]。研究表明，器质性心脏病中存在着CaMKⅡ的表达和功能上调，CaMKⅡδB和CaMKⅡδC过度表达的转基因小鼠均可导致心肌肥厚和心力衰竭，更易于诱发心律失常^[14]。Liu等^[15]研究发现，将CPVT的RyR R4496C转基因小鼠与CaMKⅡδC过度表达的转基因小鼠杂交，发现其后代CaMKⅡδC/RyRR4496C小鼠在9~10周时产生自发性的恶性室性心律失常，并导致猝死。本文的结果提示，KN93可以降低心衰时心室肌细胞DAD，减少TA，说明CaMKⅡ在心衰时细胞内钙处置以及心律失常发生方面起着重要的作用，同时，也提示KN93具有潜在的抗心律失常效应，具有一定的研发前景。

心衰时Ca循环发生复杂的重构，既有代偿性的改变，又有发生在舒张期的DAD出现。DAD发生的离子基础与Na /Ca交换体(NCX)的反向转运有关，后者可使细胞内Ca²⁺浓度增高，从而诱发瞬时内向电流(I_ti)，使震荡电位的幅度升高，当达到阈电位时将引发一次除极，即触发活动，在一次TA后，DAD幅度可更大，从而导致一连串TA，表现为室性心动过速，包括多形性室速和尖端扭转型室速，严重危及患者的生命^[16-17]。本研究显示，KN93可降低心衰时心室肌细胞内静息态钙浓度，减少I_ti，这可能是其减少DAD和TA的主要原因。同时也反映了CaMKⅡ抑制虽然没有改变NCX1.1的表达，但可能改变NCX交换体的功能，进而减少Iti电流。

KN93可以上调肌浆网Ca²⁺-ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase，SERCA2a)和pPLN的表达，提示其可以增加细胞内Ca²⁺的摄取。生理状态时，去磷酸化的PLB(Phospholamban，PLN)通过降低SERCA与Ca²⁺亲和力，抑制SERCA功能，故PLB磷酸化可能解除抑制。心衰时PLN的活性降低，即磷酸化状态下调，使SERCA2a与Ca²⁺的亲和力下降，肌浆网再摄取胞浆中Ca²⁺能力降低，舒张期胞浆中Ca²⁺增高和心脏舒张功能下降^[18-19]。本文结果显示，KN93虽然不能改变PLN，但可以上调pPLN，增加SERCA2a与Ca²⁺的亲和力，促进胞内钙摄取, 进而达到降低DAD和TA的目的。这可能是CaMKII抑制能够减少心衰时DAD发生的又一原因。本研究并未发现抑制CaMKII对RyR2表达的影响，但心衰时RyR2-Ser2815位点的磷酸化水平显著增加，舒张期出现钙离子渗漏。而应用KN93后，可降低过度磷酸化RyR2，减少舒张期细胞内Ca²⁺，降低触发性心律失常的发生。