脓毒症是宿主对感染产生的免疫失调反应，导致危及生命的器官功能障碍的综合征，脓毒症和脓毒症休克是ICU最常见的危重病，有极高的病死率^[1-2]，虽然目前脓毒症的发病机制仍然不明确，但是认为免疫紊乱是脓毒症发病的重要关键，感染造成的免疫失调在不同的阶段导致宿主机体的损伤^[3]。因此深入了解脓毒症免疫发病机制，对于脓毒症的诊断和治疗都十分关键^[4]。外周血单个核细胞是机体的免疫组分之一，能直接反映宿主的免疫情况，又相对容易获取，研究表明脓毒症发病发展过程中外周血单个核细胞有着明显的变化。严重脓毒症能造成固有免疫和适应性免疫细胞的大量消耗，脓毒症可导致死亡患者脾脏中B细胞、CD4+T细胞和树突状细胞大量丧失。在严重脓毒症中，淋巴细胞和树突状细胞能加速免疫细胞凋亡，凋亡细胞能加速抗炎细胞因子的释放^[5]。还有研究发现脓毒症的发展过程中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞显著降低，T细胞在脓毒症患者中主要分化为Th2而不是Th1和Th17^[6]。然而具体机制尚不明确。

基于质谱的蛋白组学已经成为研究复杂高通量小分子蛋白的主流工具，近年来发展的DIA技术将整个扫描范围分为多个窗口，依次选择碎裂采集所有母离子全部子离子的信息，做到非目标性，通量无上限，能大规模高通量地相对定量和绝对定量^[7-8]。为了研究脓毒症的发生对免疫细胞的影响，进一步研究脓毒症患者外周血单个核细胞的差异蛋白，本研究在四级杆离子阱串联的高分辨质谱(quadrupole-Orbitrap LC-MS)采用数据非依赖性采集(DIA)的蛋白组学技术，分析比较脓毒症患者外周血单个核细胞，为脓毒症的发病机制提供基础，为免疫治疗的研究提供靶标。

收集2016年4月至2016年7月复旦大学附属上海市第五人民医院中心监护室收治的10例脓毒症和10例疾病对照患者，对其临床资料和外周血样本进行前瞻性研究，脓毒症的诊断标准符合2016年2月第三次脓毒症和脓毒症休克定义的国际共识诊断标准(sepsis-3)^[9]：有明确感染证据加上入院后SOFA评分变化≥2；年龄≥18岁。排除标准：①存在自身免疫性疾病，先天或者获得性免疫缺陷病；②近半年有使用免疫抑制病史；③孕妇；④严重的心力衰竭(NYHA Ⅳ)，严重的肝病(Child评分10分以上)，慢性肾脏病需要透析；⑤住ICU未满24 h。本研究通过复旦大学附属第五人民医院伦理委员会批准，患者或者家属签署知情同意书。

Q-Exactive plus质谱仪(赛默飞世尔科技公司，美国)；EASY-nLC 1000纳流超高效液相色谱(赛默飞世尔科技公司，美国)；乙腈(acetonitrile，ACN)(Sigma aldrich公司，美国)；甲酸(formic acid，FA)(赛默飞世尔科技公司，美国)；人淋巴细胞分离管(达科为生物技术公司，中国上海)；BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞世尔科技公司，美国)；蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail tablets)(罗氏公司，德国)；三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP](Fluka公司，德国)；ALS酸不稳定表面活性剂为系统生物研究院配置提供；碳酸氢铵、氢氧化钠、氯化钙、碘乙酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等化学纯级别试剂均购自中国生工生物(上海)股份有限公司；胰蛋白酶(赛默飞世尔科技公司，美国)；ELISA试剂盒(R & D，美国)；实验用水均为Mili-Q纯水仪制备的去离子水。

疑似脓毒症患者在ICU发生高热，获得家属或本人知情同意后，在留取高热血培养的同时，留取5 mL外周静脉血，床边采用EDTA管抗凝，于4 h内到实验室用人淋巴细胞分离管收集提取外周血单个核细胞。外周血单个核细胞采用细胞裂解液(0.2% ALS，20 mmol/L HEPES，1X蛋白酶抑制剂)冰上裂解25 min，13 000 r/min离心20 min提取上清液蛋白，-80 ℃保存备用。待患者血培养结果阳性后制备质谱蛋白样品。

BCA法测定蛋白浓度以后，取50 μg蛋白，室温条件下加入6 mol/L尿素使蛋白变性反应30 min，55 ℃条件下加入5 mmol/L TCEP还原反应30 min，加入碘乙酰胺使溶液终浓度变为6.25 mmol/L，室温避光反应1 h，用6倍体积的碳酸氢铵溶液稀释，1 mmol/L氯化钙增强胰酶活性，在碱性环境中使用胰酶变性，37 ℃反应16 h，用含有C18填料的96孔柱除盐，然后使用冷冻离心机冷冻干燥。

DDA和DIA的质谱数据EASY nLC-1000 UPLC系统联合Orbitrap质谱检测器Q-Exactive plus质谱仪上采集，上样量均为1 μg，在同一根自制C18的分析柱(规格为75 μm×15 cm)上面进行，分离相：A相0.1%甲酸，B相0.1%甲酸+80%乙腈，分析环境温度保持在4 ℃。梯度洗脱的程序见表 1。

DDA扫描：采用正离子扫描模式，扫描范围是400~1 200 m/z，扫描时间为75 min。一级扫描模式：全扫描；一级扫描范围：400~1 200 m/z；一级检测：轨道分辨率70 000 (@m/z 200)；自动增益控制(automatic gain control ACG)：3×10⁶；最长注射离子时间：50 ms；loop count：20；选择电荷数为：2~7；二级质谱碎裂模式HCD；碰撞能量NCE：27%；二级AGC：5×10⁵。

DIA数据采集：一级扫描模式：全扫描；一级扫描范围：400~1 200 m/z；一级检测分辨率35 000 (@m/z 200)；AGC：3×10⁶，窗口：32个固定窗口，每个窗口依次选择、碎裂、采集窗口内所有母离子的全部子离子信息用于定量。

DDA的数据采用软件Proteome Discoverer (V1.4.1.14)进行搜库，数据库是Uniprot人类蛋白数据库(201702人类非冗余蛋白数据库)，胰酶漏切位点设为0；固定修饰半胱氨酸烷基化(57.021 Da)；非固定修饰甲硫氨酸氧化(15.994 Da)；肽段的FDR：低于1%。搜库结果导出以.msf格式导入软件Skyline(Skyline-daily 3.5.1.9283版本)用于建库和DIA数据分析提取。Skyline建库以及DIA数据导入参考Skyline官网数据非依赖采集数据处理教程，将DIA数据依次导入，最小峰检出比为0.01，每个母离子最小离子对为6，峰模型评分Q值为0.01，用于控制鉴定蛋白质量的dotp值中，min dotp值设为0.8。选择+1和+2价子离子，用肽段特征碎片离子的面积对肽段进行定量。最后导出蛋白、多肽、子离子，以及定量峰面积等信息。对DIA定量数据用峰面积中位数进行归一化处理后分别删除脓毒症组和疾病对照组中样本间超过25%的缺失值的子离子。在碎片离子水平对于两组之间的差异进行定量分析。

DAVID(database for annotation, visualization and integrated discovery)是一个生物信息数据库，它通过从基因数据或者蛋白数据中系统提取生物信息然后整合生物学数据的分析工具。将筛选出的差异蛋白在DAVID网站上做KEGG通路分析，GO分析。从蛋白质的生物过程(biological process)、分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)3个方面对蛋白分别进行基因富集分析。结果采用Benjamini矫正法矫正P值进行筛选，矫正P < 0.05，结果有统计学意义。

采用双抗体夹心酶免疫分析法(ELISA法)测定疾病对照组(10例)，脓毒症组(10例)的外周血单个核细胞中的HMGB-1、NGAL、MMP-8的含量，将裂解的外周血单个核细胞蛋白稀释100倍，操作步骤严格按照试剂盒说明书步骤进行。

使用数据分析软件R(version 3.2.2)对DIA数据进行归一化处理，并且用R软件对于碎片离子数据进行主成分分析分析法(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判别法(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)以及强调组间差异的正交信号偏最小二乘判别分析法(orthogonal signal correction-partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)模式识别，分别得到二维得分图，并且对于模型进行评价，对候选差异子离子进行加和至肽段。通过PLS-DA模型中的变量投影重要性标志(VIP)值来筛选候选的差异蛋白，VIP > 1，差异蛋白有意义。采用Graphpad Prim 6.0软件对ELISA数据进行分析，数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用成组t检验，对于标志物的评价利用外周血单个核细胞的蛋白表达构建ROC分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

10例脓毒症患者外周血样本来自2016年4月至2016年7月复旦大学附属上海市第五人民医院中心监护室住院的患者，其中男性5例，女性5例，年龄38~78岁，平均64.9岁；满足脓毒症诊断标准，在留取高热血培养同时留取5 mL外周血，血培养阳性后入组，其中革兰阳性菌4例，革兰阴性菌3例，混合感染(包括真菌)3例；肺部感染4例，腹腔感染2例，泌尿系统感染2例，其他部位感染2例；感染发生前均未使用抗生素治疗。疾病对照组为术后监护患者，男性5例，女性5例，年龄44~73岁，平均年龄61.7岁，术后未并发感染，留取疾病对照组清晨空腹外周静脉血5 mL。

20个样本建库总共获得176 797碎片离子，21 126肽段，2 368蛋白，20个DIA样本用skyline筛选鉴定到的49 121个碎片离子，7 280个肽段, 2 071个蛋白。采用PCA、PLS-DA、OPLS-DA进行模式识别，分别输出二维得分图(图 1)。由图可见PCA、OPLS-DA、PLS-DA三个模型均能很好将脓毒症组和疾病对照组明显区分开。由图 1A中PCA得分图可见PCA能很好区分疾病对照组和脓毒症组，PCA模型主要参数是R2X，R2X表示模型对X变量的解释能力，R2X越接近1越好，本次PCA的模型评价指标R2X为0.74，说明模型稳定性较好，脓毒症组和对照组两组存在生物差异明显。R2Y和Q2是PLS-DA和OPLS-DA的模型评价参数，R2Y表示模型对于Y变量的解释能力，Q2表示表示模型的预测能力，R2Y和Q2越接近1表明模型越稳定可靠，一般Q2大于0.5表示模型稳定可靠。在图 1B中，PLS-DA模型的这些碎片可以解释两组差异98.9%的变化，可以预测两组差异92.6%。在图 1C中，OPLS-DA模型中这些碎片离子可以解释两组差异98.9%的变化，可以预测两组差异92.6%。表明在这组数据中两组模型的区分能力相同，OPLS-DA和PLS-DA模型比PCA更加稳定可靠。将这些碎片离子进行加和，得到119个差异蛋白，其中31个高表达，88个低表达。在蛋白水平再次进行模型识别，仍可以区分两组。为了更加直观地显示样本之间的关系以及不同的差异蛋白在不同的样本之间的表达差异，利用定性的显著性差异蛋白表达量对各组样本之间进行层次聚类(hierarchical clustering)，见图 2。

图 1 PCA，PLS-DA，OPLS-DA模式识别的二维得分图 Figure 1 2D-score map of PCA, PLS-DA, OPLS-DA pattern

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图 2 差异蛋白的聚类分析热图 Figure 2 Cluster heat map of differential proteins

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对这119个蛋白进行GO分析, 结果如图 3所示，GO分析中，在细胞组分(图 3A)中，细胞外泌体、胞质，以及细胞膜是富集到最多的细胞组分。血小板脱颗粒，受体介导内吞以及细胞粘附反应是聚类到最多的生物功能(图 3B)，这些功能与脓毒症免疫激活和脓毒症的发展密切相关。可能与病原体激活宿主细胞吞噬病原体的过程有关。在分子功能(图 3C)上蛋白结合，poly(A) RNA结合，细胞粘附以及铁离子结合是最多见的分子功能，这可能与T细胞激活，以及免疫细胞杀菌作用以及脓毒症发生相关^[10]。对这些蛋白进行KEGG分析(图 3D)，富集到前10个通路中有细菌侵袭上皮细胞、碳代谢通路、代谢通路、血小板激活、补体和凝血瀑布，这几条通路与脓毒症的发生发展密切相关。

图 3 差异蛋白GO分析和KEGG通路分析图 Figure 3 GO analysis and KEGG pathway diagram of differential proteins

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对于鉴定到的119个蛋白通过OPLS-DA模型中VIP值进一步筛选，VIP > 1，P < 0.05为差异蛋白候选的标志物，总共筛选出46个差异蛋白，结果如表 2所示。其中，贡献最大的前3个蛋白，分别是高迁移率蛋白1(HMGB-1)，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，基质金属蛋白酶8(MMP-8)。对这三个蛋白进行ELISA验证，其中HMGB-1在疾病对照组和脓毒症组外周血单个核细胞的表达分别为(50.50±6.039)ng/mL、(174.0±9.887)ng/mL，脓毒症组显著升高(t=10.66，P < 0.01)。MMP-8在疾病对照组和脓毒症组外周血单个核细胞的表达分别为(94.87±7.665)ng/mL、(491.0±48.73)ng/mL，脓毒症组显著升高(t=8.03，P < 0.01)。NGAL在对照组和脓毒症组外周血单个核细胞的表达分别为(158.6±13.72)ng/mL、(1 119±95.64)ng/mL，脓毒症组明显升高(t=9.942，P < 0.01)。见图 4。ELISA验证结果与质谱检测结果一致。

图 4 ELISA检测HMGB-1，MMP-8，NGAL的表达 Figure 4 The expression of HMGB-1, MMP-8, and NGAL detected by ELISA

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将10例对照组和10例脓毒症组外周血单个核细胞ELISA检测数据，采用Graphpad Prim 6.0软件建立ROC诊断模型，结果如图 5所示。HMGB-1的曲线下面积和临界值分别为0.896和116.11 ng/mL，曲线下面积95%可信区间为0.784~1，灵敏度与特异度为0.833和0.867。NGAL的曲线下面积和临界值分别为0.911和232.38 ng/mL，曲线下面积95%可信区间为0.824~0.988，灵敏度与特异度分别为0.803和0.667。MMP-8的曲线下面积和临界值分别为0.916和203.69 ng/mL，曲线下面积95%可信区间为0.827~1，灵敏度与特异度分别为0.833和0.867。

图 5 HMGB-1，MMP-8，NGAL诊断脓毒症的ROC曲线 Figure 5 ROC curves of HMGB-1, MMP-8, NGAL for diagnosis of sepsis

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基于DIA的蛋白组学是新兴的定量蛋白组学方法，通过将整个质量范围等分为多个窗口，每个窗口一次选择，碎裂，扫描。DIA能够获得质量范围内母离子全部碎片离子信息，通量大，循环时间固定，同时数据可以回溯，解决了传统的蛋白组学shortgun和目标采集的方法存在的问题^[11]。脓毒症的发病机制涉及多器官多系统的异常，而且其发病过程复杂，机体失控的炎性反应被认为是脓毒症发病的重要基础，抗炎和促炎的失衡，启动炎症联级反应，造成对宿主的损害。

本研究中，脓毒症患者和对照组的119个差异蛋白蛋白中，包括有血管性血友病因子(VWF)，踝蛋白(TLN1)，转铁蛋白(TF)以及载脂蛋白A1(Apo1)，这些蛋白与细胞脱颗粒和凝血系统的活化有关。近年来凝血系统的激活也被认为是脓毒症组织损伤机制之一。还有Toll相互作用蛋白(TOLLIP)，高迁移率族蛋白(HMGB-1)，Trem样转录因子1(TREML1)在脓毒症组中表达显著增加，可能与固有免疫反应和促炎因子激活有关。此外在脓毒症组中高表达S100钙结合蛋白(S100A9)，整合素亚基β2(ITGB2)和乳铁蛋白(LTF)，参与了NF-κB转录因子的激活以及TLR4信号通路的正向调节。这些生物作用调节引发促炎因子的释放，促进脓毒症的发展。通过蛋白组学的方法可以更加深入了解脓毒症的发展机制。脓毒症是多因素的免疫介导的复杂性疾病。本研究进行验证的三个蛋白均为既往报道过的血浆中的炎症介质，发现在外周血单个核细胞中也有相同的作用。

高迁移率蛋白1(HMGB-1)是一种晚期炎症递质，是一种内源性危险信号，被主动分泌和被动释放到细胞外的HMGB-1可诱发局部炎症，能激发细胞因子超表达，加剧炎症联级反应，外周血细胞受到特异性的抗原刺激后能主动分泌HMGB-1^[12]。凋亡细胞二次坏死释放HMGB-1作为内源性坏死因子激发细胞因子，联级反应加剧单核/巨噬细胞的致炎反应^[13]。有动物研究表明，抑制HMGB-1的致炎作用可达到治疗重症感染的目的^[14-15]。细胞外的HMGB-1在炎症种调节T细胞分化，调节抗炎反应^[16]。本研究中质谱和ELISA验证中脓毒症患者外周血单个核细胞HMGB-1高表达，可能与免疫细胞炎症的启动、维持和炎症放大的联级反应有关。

目前，血浆和尿液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)被认为是急性肾损伤的生物标志物之一^[17]。NGAL是由肝细胞和免疫细胞分泌的小分子蛋白，能和细胞中铁螯合分子结合，与细菌生长和组织分化密切相关，通过宿主细胞中的NGAL通过螯合铁限制细菌生长达到抗菌作用^[18]。本研究通过质谱发现在脓毒症患者的外周血单个核细胞中NGAL的升高，可能与宿主感染时候固有免疫抗菌作用有关。将NGAL作为脓毒症外周血细胞标志物发现NGAL在诊断脓毒症时有较好敏感度，然而特异度却不高。

基质金属蛋白酶8(MMP-8)能够降解基质中大部分成分，如胶原、蛋白聚糖、糖蛋白等，正常情况下含量极低，在炎症条件下MMP-8表达增加，导致组织的破坏^[19-20]。有研究表明MMP-8与脓毒症严重程度密切相关^[21]，能激活巨噬细胞中NF-κB促炎性转录因子^[20]，可能是脓毒症潜在的治疗靶点^[21-22]。本研究中脓毒症组的外周血中MMP-8显著增高。

此外，脓毒症的发生与多种通路的激活有关，在通路富集中细菌侵袭上皮细胞、碳代谢通路、代谢通路、血小板激活、补体和凝血瀑布、激活抗体生成都在此次通路分析中富集得到。脓毒症的发展使免疫调控紊乱，机体对于严重感染应答失调导致多器官功能障碍，免疫的调控由过度免疫的激活发展至广泛的致死性的免疫抑制，这些仍需要进一步深入研究。

本研究应用DIA-MS在外周血单个核细胞中寻找脓毒症与疾病对照的差异蛋白，但是本研究也有不足之处：所有样本均来自于同一所医院ICU，由于收取样本条件限制样本数目也较有限。对于目标蛋白的验证和评价，脓毒症的发展预后等进一步探索和脓毒症的机制研究需要进一步扩大样本量。作为脓毒症感染与蛋白组学的初步探索为后续脓毒症的免疫研究提供基础，为脓毒症的诊断和治疗提供靶标。