2019, Vol. 28
脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1]。肺脏是脓毒症时最易受损的器官。脓毒症可引起肺组织氧自由基大量产生，其所致的氧化/抗氧化失衡及氧化应激反应是引起肺损伤的重要原因。
核因子E2相关因子2转录因子（nuclear factor E2-related factor-2, Nrf2）属于Cap ' n' Collar家族，是调节细胞内众多抗氧化物表达的关键性因子[2]。研究发现在急性肺损伤过程中，Nrf2具有保护作用并且是通过调节机体氧化应激反应实现的[3]。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）属于组蛋白去乙酰化酶超家族, 共有Ⅰ~Ⅳ四型，其中Ⅰ型中HDAC2具有很强的组蛋白去乙酰化活性，其对Nrf2乙酰化水平的影响和相关疾病的关系日益受到重视[4-5]。本研究通过体外实验初步探讨HDAC2介导Nrf2乙酰化/去乙酰化在脓毒症急性肺损伤中的作用，为脓毒症急性肺损伤治疗提供新的理论策略。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂健康雄性清洁级BALB/c小鼠，体质量20~25 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。小鼠饲养及动物实验在温州医科大学实验动物中心进行，使用许可证号：SYXK（浙）2010.0150。实验遵循国际通行的动物福利和伦理准则。兔抗HDAC2多克隆抗体、兔抗Nrf2多克隆抗体、protein A/G-beads、抗乙酰化赖氨酸抗体（均购于Santa Cruz Biotechnology公司，加利福尼亚，美国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（温壳生物科技有限公司，浙江，中国），羊抗兔二抗（温壳生物科技有限公司，浙江，中国），脂多糖（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，美国），CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）（日本同仁），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（西唐生物科技有限公司，上海，中国）。
1.2 分离培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞将BALB/c小鼠颈部脱位处死，快速取出双肺，置于75%乙醇中浸泡5 min，取出后至超净台中操作，快速完整地取下肺组织，尽可能清除干净残留的气管组织和结缔组织后置于预冷的PBS液中，清洗2~3次。磷酸盐缓冲液洗涤肺组织两次。将肺组织剪为碎块，用胰酶溶液清洗1次，然后用胰酶溶液于37 ℃搅动消化15 min。用等量含10%胎牛血清（FBS）的M199完全培养基终止胰酶消化，200目筛网过滤后，1 500 r/min低温离心5 min，弃去上清液，收集沉淀。将分离的细胞加入含10% FBS的M199培养基制成悬液接种入培养瓶中，置于37 ℃，5% CO2培养箱内培养。
1.3 实验分组与处理常规分离培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，用不同浓度的LPS（10、100、1 000 ng/mL）刺激3 d，CCK-8检测细胞活性，与对照组相比，存活率有差异的浓度作为实验浓度。然后用此浓度LPS分别在0、6、12、24及48 h时用CCK-8检测细胞活性，选择存活率出现差异的时间点作为本实验的时间点。
常规培养Ⅱ型肺泡上皮细胞，随机分为对照组、LPS组、HDAC2慢病毒干扰组（siRNA-HDAC2组）、HDAC2慢病毒过表达组（LV-HDAC2组）。siRNA-HDAC2组和LV-HDAC2组经过慢病毒转染后予LPS刺激，LPS浓度和刺激的时间点依据第一部分实验结果。
1.4 CCK-8法检测细胞存活率细胞以8×104个/mL密度接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞培养24 h后，每孔加入100 μL不同浓度的受测试样品，培养不同时间后，每孔加入100 μL完全培养基，继续培养2 h。选择450 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度（A）值，计算细胞相对存活率。存活率=[（A实验组-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]× 100%。
1.5 慢病毒构建与转染HDAC2过表达及沉默慢病毒的构建交于上海锐赛生物技术有限公司进行。小鼠LV-HDAC2的序列是5' -AAGCTTTTTATACAACAGATC-3' ，小鼠siRNA-HDAC2的序列为5' -GACTGTCGACTCGACCCTCCT-3' 。将细胞接种在6孔板中，然后将感染复数（multiplicity of infection, MOI）等于80的病毒颗粒与RPMI-1640培养基预混合，并添加到6孔板中。12 h后，用新鲜培养基代替培养基。48 h后，在荧光显微镜下观察细胞。
1.6 Western blot法检测HDAC2、Nrf2蛋白表达常规提取细胞胞浆及胞核蛋白，BCA检测核蛋白浓度。制备上样缓冲液，蛋白上样量为30 μg；配制10%的分离胶和5%的浓缩胶（聚丙烯酰胺凝胶）；电泳在浓缩胶中80 V，20 min，分离胶中120 V，60 min；半干式电泳仪转膜100 mA，70 min；5%脱脂牛奶室温下封闭过夜；加入一抗，4 ℃孵育过夜用PBST洗膜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，再用TBST洗膜，ECL显影，用图像分析系统分析蛋白条带灰度值。
1.7 免疫共沉淀法检测Nrf2乙酰化水平收获细胞，加入适量IP裂解液，冰上裂解30 min，12 000 g离心30 min取上清液。取200 μg的蛋白上清液用缓冲液稀释至100 μL，加入1 μg抗Nrf2抗体，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜，并加入50 μL protein A琼脂糖珠，4 ℃振荡过夜。免疫沉淀反应后，在4 ℃以3 000 r/min速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底，Western blot分析Nrf2乙酰化水平，一抗选用乙酰化赖氨酸抗体。
1.8 Nrf2蛋白稳定性检测处理后的细胞以0.5 μg/mL的放线菌酮（cycloheximide）抑制细胞蛋白质合成，应用Western blot法检测放线菌酮作用后各时间点（0、5、20、40、80 min）Nrf2蛋白量的变化。
1.9 SOD、MDA检测经过不同处理后，收集细胞上清液，化学比色法测定上清液SOD、MDA水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.10 统计学方法计量资料若服从正态分布则以均数±标准差（Mean±SD）表示，应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 LPS刺激对小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的存活率的影响如图 1所示，分别用10、100、1 000 ng/mL的LPS刺激小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞3 d，发现10 ng/mL及100 ng/mL的LPS刺激后小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率未见明显下降（P > 0.05），而1 000 ng/mL的LPS刺激后，小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率为（60.13±0.03）%，存活率明显下降（P < 0.05）。如图 2所示，用1 000 ng/mL的LPS刺激刺激小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，分别在0、6、12、24及48 h时用CCK-8检测细胞活性。结果发现，随着刺激时间延长，小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率逐渐下降。LPS刺激24 h时，小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率为（66.54±0.02）%，存活率明显下降（P < 0.05）。因此，在后面的实验中采用1 000 ng/mL的LPS刺激24 h。
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| aP < 0.05 图 1 不同浓度LPS对小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率的影响 Fig 1 Effect of different concentrations of LPS on survival of mouse typeⅡalveolar epithelial cells |
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| aP < 0.05 图 2 不同时间点LPS对小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞存活率的影响 Fig 2 Effect of LPS on survival of mouse typeⅡalveolar epithelial cells at different time points |
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将慢病毒载体转染小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，培养72 h后，Western Blot检测HDAC2蛋白的表达。与对照组相比，siRNA-HDAC2组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内HDAC2蛋白表达量减少，差异有统计学意义（t=5.196，P=0.035），而LV-HDAC2组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内HDAC2蛋白表达量增加，差异有统计学意义（t=5.877，P=0.027），见图 3。
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| 与对照组比较，aP < 0.05 图 3 慢病毒载体转染小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后HDAC2蛋白表达 Fig 3 Expression of HDAC2 protein after transfection of lentiviral vector into mouse type Ⅱ alveolar epithelial cells |
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小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞经过不同处理后HDAC2的蛋白表达如图 4所示，与对照组相比，LPS刺激后HDAC2的蛋白表达水平升高（t=5.974，P=0.027）。与LPS组相比，LV-HDAC2组HDAC2的蛋白表达水平明显升高（t=11.69，P=0.007 2）。与LPS组相比，siRNA-HDAC2组HDAC2的蛋白表达水平下降（t=6.102，P=0.025 8）。
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 4 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞HDAC2的蛋白表达 Fig 4 Protein expression of HDAC2 in typeⅡalveolar epithelial cells of each group |
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免疫共沉淀法检测各组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞Nrf2乙酰化水平，如图 5所示，与对照组相比，LPS刺激后Nrf2乙酰化水平降低（t=7.223，P=0.002），过表达HDAC2后，Nrf2乙酰化水平降低更明显（t=11.29，P=0.000 4）。而干扰HDAC2的表达后，Nrf2乙酰化水平升高（t=17.86，P < 0.01）。
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 5 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞Nrf2乙酰化水平 Fig 5 Acetylation level of Nrf2 in typeⅡalveolar epithelial cells of each group |
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蛋白免疫印迹法检测各组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞Nrf2蛋白表达水平，如图 6所示，与对照组相比，LPS刺激后Nrf2蛋白水平升高（t=2.929，P=0.043）。与LPS组相比，过表达HDAC2后，Nrf2蛋白表达水平升高明显（t=3.194，P=0.033）。而干扰HDAC2的表达后，Nrf2蛋白水平降低（t=9.359，P=0.000 7）。
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 6 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞Nrf2的蛋白表达 Fig 6 Protein expression of Nrf2 in typeⅡalveolar epithelial cells of each group |
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如图 7所示，对照组Nrf2蛋白的表达随着时间的增长逐渐下降，5、20、40及80 min时Nrf2的蛋白相对表达量分别是（90.23±3.78）%、（78.23±5.45）%、（62.76±5.65）%、（50.21±4.98）%，LPS刺激后Nrf2的蛋白稳定性升高。与LPS组相比，上调HDAC2后蛋白稳定性升高，而下调HDAC2后蛋白稳定性下降。
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 7 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞Nrf2的蛋白稳定性 Fig 7 Protein stability of Nrf2 in type Ⅱ alveolar epithelial cells |
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为了阐明调控HDAC2表达对LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激的影响，本研究检测了SOD、MDA的水平，如图 8所示，对照组SOD活性为（191.7±6.009）U/mgprot，而LPS刺激后SOD活性下降（t=121，P < 0.01）。与LPS组相比，LV-HDAC2组SOD活性升高（t=4.678，P=0.009），而siRNA-HDAC2组SOD活性降低（t=2.87，P=0.045）。如图 9所示，对照组MDA含量为（2.25±0.258）nmol/mgprot，而LPS刺激后MDA含量升高（t=10.45，P=0.000 5）。与LPS组相比，LV-HDAC2组MDA含量下降（t=5.417，P=0.005 6），而siRNA-HDAC2组MDH含量升高（t=5.291，P=0.006）。
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 8 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞SOD的水平 Fig 8 The level of SOD in typeⅡ alveolar epithelial cells of each group |
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| 与对照组比较，aP < 0.05;与LPS组比较，bP < 0.05 图 9 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞MDA的水平 Fig 9 The level of MDH in typeⅡalveolar epithelial cells of each group |
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生理状态下，肺内产生少量自由基，这些自由基参与解毒、吞噬等生理功能，且肺内存在超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽转移酶等抗氧化酶或自由基清除剂，能及时清除多余的活性自由基。因此健康肺脏内存在着氧化/抗氧化的动态平衡。
在脓毒症状态下，肺组织内大量中性粒细胞和巨噬细胞被激活，促使循环和肺局部的氧自由基增多，增加的活性自由基又可使巨噬细胞和中性粒细胞在肺组织聚集、激活，进一步释放自由基和溶酶体酶等，形成氧化应激。氧化应激产生的过量活性自由基超过肺内抗氧化系统的清除能力，打破了肺内氧化和抗氧化的动态平衡并形成恶性循环，最终导致肺损伤的发生。本研究通过LPS刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞制作脓毒症模型，通过体外实验发现LPS刺激后Ⅱ型肺泡上皮细胞中SOD活性下降，MDA水平升高，氧化应激损伤加重。
Nrf2是调节细胞内众多抗氧化物表达的关键性因子，在生理状态下，Nrf2蛋白与肌动蛋白结合蛋白结合，锚定于细胞质中，处于失活状态[6]；在应激状态下，Nrf2与肌动蛋白结合蛋白解离，并进入细胞核，与细胞核内抗氧化应答元件结合，然后激活下游解毒酶和抗氧化物酶基因的表达，如SOD和HO-1等，从而发挥其抗氧化作用[7-9]。已有文献证实在急性肺损伤中Nrf2具有保护作用，并且是通过调节机体氧化应激反应实现的[3, 10-11]。本研究发现LPS刺激后Nrf2表达升高，原因可能是LPS刺激后导致氧化应激加重，Nrf2应激性升高应对氧化应激损伤。
核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化与基因调控相关。有研究发现，去乙酰化酶抑制剂能够显著抑制氧化应激后Nrf2蛋白表达和活性，下游抗氧化分子的表达降低，认为去乙酰化在维持Nrf2蛋白的稳定性和活性中起着重要的作用[3]。也有研究报道组蛋白乙酰转移酶能增加Nrf2的核转移，并上调下游抗氧化分子的表达[4]。因此机体的乙酰化状态可能影响Nrf2表达从而影响机体氧化应激。本研究发现LPS刺激后HDAC2的蛋白表达升高，Nrf2乙酰化水平降低，Nrf2的稳定性增强，Nrf2的蛋白表达升高，应对氧化应激损伤。笔者推测脓毒症或应激状态下HDAC2可降低Nrf2的乙酰化水平，提高Nrf2表达和稳定性。本实验通过慢病毒下调和过表达HDAC2，进一步验证HDAC2可调节Nrf2乙酰化水平进一步调节Nrf2的表达。Mercado等[12]研究发现下调HDAC2可导致Nrf2蛋白稳定性下降，表达降低，抗氧化基因表达减少，对氧化应激敏感性增加，致使炎症加重，这与本研究结果一致。也有研究发现HDAC2是吸入毒物介导的肺部炎症的一个关键因素，敲除Nrf2小鼠的肺组织HDAC2水平降低，炎症反应增加[13]。而相关研究在脓毒症中也有报道，有研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A对脓毒症小鼠急性肺损伤具有保护作用，可能与通过降低炎症反应及减少凋亡有关[14]。在脓毒症模型中，Takebe等[15]发现抑制组蛋白去乙酰化酶可以减轻脓毒症小鼠肺脏和脾脏凋亡，但其具体机制尚不清楚。有研究发现HDAC2可通过调节c-Jun/PAI-1通路抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应[16]。Nrf2在脓毒症中的表达也有报道，有研究发现在脓毒症大鼠模型中，肝组织Nrf2水平在6 h时上升，12 h后下降[17]。在金黄色葡萄球菌腹膜炎小鼠模型中，Nrf2水平在6、24及48 h都升高，在6 h升高明显[18]，这可能与模型不同，疾病严重程度不同有关。
SOD、MDA是氧化应激的重要指标。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的细胞损伤。MDA是脂质发生过氧化反应的产物。SOD、MDA对评估脓毒症氧化应激及预后都有重要的价值[19-20]。本研究发现LPS刺激后Ⅱ型肺泡上皮细胞中SOD活性下降，MDA升高。抑制HDAC2后，Nrf2表达降低，氧化应激加重；而上调HDAC2后，Nrf2表达升高，Nrf2可能与肌动蛋白结合蛋白解离并进入细胞核，与细胞核内抗氧化应答元件结合，然后激活下游解毒酶和抗氧化物酶基因的表达，SOD升高，从而使氧化应激减轻。
综上所述，LPS可诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化损伤，而HDAC2可使Nrf2去乙酰化，上调Nrf2的表达，减轻氧化应激。本研究只是体外研究，不能准确模拟脓毒症致病过程，因此，下一步将进行体内实验进一步探究其机制，为脓毒症急性肺损伤治疗提供新的理论依据。
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