中华急诊医学杂志  2019, Vol. 28 Issue (6): 702-706   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.06.009
蒙古族早产儿呼吸窘迫综合征与SP-A1 rs1059047、rs1136450位点基因多态性相关性研究
新春 , 梅花 , 张钰恒 , 张亚昱 , 宋丹 , 月小飞 , 王美琪     
内蒙古医科大学附属医院新生儿科, 呼和浩特 010050
摘要: 目的 研究肺表面活性物质蛋白A1(pulmonary surfactant protein A1,SP-A1)rs1059047、rs1136450位点基因多态性与蒙古族早产儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrom,RDS)的相关性。方法 采用病例对照研究方法,以内蒙古西部地区蒙古族RDS早产儿50例(男33例,女17例)为病例组,以同民族、同性别、胎龄相近的非RDS早产儿50例(男29例,女21例)为对照组,应用聚合酶链式反应-单链构象多态性基因检测技术(polymerase chain reaction,single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)对SP-A1单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(rs1059047、rs1136450)和等位基因单倍体(6A、6A2、6A3)进行检测。结果 病例、对照组rs1059047位点均可检测出3种基因型CC、TT、CT,均以TT基因型为主,2组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.429,P > 0.05);病例、对照组rs1136450位点均可检测出2种基因型CG、GG,均以CG基因型为主;2组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.624,P > 0.05);SP-A1等位基因单倍体6A、6A2、6A3的分布频率在RDS组分别为36%、68%、42%;在对照组分别为62%、46%、50%。2组间等位基因单倍体6A3频率差异无统计学意义(χ2=0.502,P > 0.05);而2组间等位基因单倍体6A、6A2频率差异有统计学意义(χ2=6.763、4.937,P < 0.05)。结论 SP-A1 (SNP)位点(rs1059047、rs1136450)等位基因及等位基因频率与蒙古族早产儿发生RDS无关;然而SP-A1等位基因单倍体6A2为蒙古族早产儿发生RDS的易感基因,单倍体6A为保护基因。
关键词: 肺表面活性物质蛋白-A1     呼吸窘迫综合征     蒙古族早产儿     基因多态性    
Correlation between polymorphisms of surfactant protein A1 rs1059047 and rs1136450 and respiratory distress syndrome in Mongolian premature infants
Xin Chun , Mei Hua , Zhang Yuheng , Zhang Yayu , Song Dan , Yue Xiaofei , Wang Meiqi     
Department of Pediatric, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medicine University, Hohhot 010050, China
Abstract: Objective To study the correlation between polymorphisms of surfactant protein A1 rs1059047 and rs1136450 and respiratory distress syndrome (RDS) in Mongolian premature infants in Inner Mongolia. Methods Totally 50 Mongolian RDS premature infants in our ward were recruited as the case group (33 males and 17 females), and another 50 Mongolian non-RDS premature infants with same ethnicity, same sex and gestational age were served as the control group (29 males and 21 females). Single nucleotide polymorphisms of SP-A1 rs1059047 and, rs1136450 and allele haploids (6A, 6A2, and 6A3) were detected by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism gene detection technology and were compared between the case and control groups. Results Three genotypes, CC, TT, CT were detected in the case and control groups at rs1059047, all of which were mainly TT genotype. There was no significant difference in genotype frequency between the two groups (χ2=1.429, P > 0. 05). Two genotypes, CG and GG, were detected in the case and control groups at rs1136450, and CG was the dominant genotype. There was no significant difference in genotype frequency between the two groups (χ2= 1.624, P > 0.05). The distribution frequency of SP-A1 allele haploids (6A, 6A2, 6A3) in the case group was 36%, 68% and 42%, respectively, and 62%, 46% and 50% in the control group, respectively. There was no significant difference in the frequency of allele haploid 6A3 between the two groups (χ2=0.502, P > 0.05); but there was a significantly difference in the frequency of allele haploids (6A, 6A2) between the two groups (χ2=6.763, 4.937, P < 0.05). Conclusions The alleles and allele frequency of SP-A1 (rs1059047, rs1136450) were not associated with RDS in Mongolian premature infants. However, SP-A1 allele haploid 6A2 is the susceptible gene for RDS in Mongolian premature infants, and haploid 6A is the protective gene.
Key words: Surfactant protein-A1     Respiratory distress syndrome     Mongolian premature infants     Gene variants    

新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)是由肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)缺乏而导致,肺泡进行性萎陷而进行性呼吸困难和呼吸衰竭的临床综合征,是导致早产儿疾病与死亡最主要因素之一[1-2]。肺表面活性物质蛋白(pulmonary surfactant protein,SP)是由卵磷脂与PS结合的蛋白质, 包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D[3]。目前国内外较多研究发现SP-B、SP-C基因多态性与RDS发病率密切相关[4-5],国外一些研究发现早产儿RDS发病率与SP-A基因多态性有相关性[6]。目前国内翟亮等[7]研究发现SP-A等位基因单倍体型与早产儿发生RDS有相关性,但局限于两个等位基因单倍体型的小样本的研究。本研究以内蒙古西部地区蒙古族早产儿为研究对象,采用PCR-SSCP基因分析技术对SP-A1 SNP位点(rs1059047、rs1136450)和等位基因单倍体(6A、6A2、6A3)进行检测,分析SP-A1基因多态性与蒙古族早产儿发生RDS的相关性,可望发现蒙古族早产儿RDS的易感基因。

1 资料与方法 1.1 一般资料

采用病例对照研究方法,病例组:①于2016年1月至2019年1月在内蒙古医科大学附属医院新生儿科住院治疗的蒙古族RDS早产儿50例;②RDS的诊断依据为欧洲颁布的RDS诊断标准[1]。对照组:①同时间段住院治疗的蒙古族非RDS早产儿50例;②普通胸片提示无肺部炎症和RDS表现;③血常规及CRP检查提示无感染者。病例对照组均排除:①遗传代谢性疾病患儿;②严重先天性疾病患儿;③生后重度窒息患儿;④母亲妊娠期糖尿病;⑤母亲孕期有明确感染史。

本研究经医院医学伦理委员会批准,血液样本采集均获得患儿家属知情同意。

1.2 方法 1.2.1 样本采集

收集蒙古族早产儿RDS患儿的抗凝全血样1.0 mL;同时收集与RDS组患儿胎龄、体质量、性别相匹配的非RDS患儿抗凝全血样本1.0 mL,放置抗凝管(EDTAK2)抗凝,置于-80℃冰箱保存备用,同时收集病例组和对照组的临床资料。

1.2.2 基因组DNA的提取,浓度测定及PCR扩增

(1)DNA提取。采用全血基因组DNA提取试剂盒的操作说明书进行基因组DNA提取;DNA质量检测:①取5 μL DNA溶液1%琼脂糖1×TAE缓冲溶液电泳(电压120~180 V)检测,单一条带说明DNA完整无降解,有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求;②分光光度计检测浓度和纯度,取1 μL检测A值,A260/280在1.7~2.0,说明DNA质量较好,小于1.7为有蛋白污染,大于2.0为有RNA污染,一般有少量的蛋白与RNA污染不影响普通PCR。

(2)引物设计。设计引物软件用Primer Premier 5,引物长度在18~30 bp;Tm值在55~65 ℃,退火温度要在60 ℃左右;GC含量40%~70%;避免连续4个碱基,尤其是G和C,3' 端最后5个碱基内最好不能有多于3个的G或C;PCR扩增产物长度:位点测序引物在150~300 bp左右,离位点80~150 bp,外显检测引物离外显子上下游150 bp左右;目的基因测序的PCR产物条带一般不超过1 200 bp。引物见表 1

表 1 SP-A1的2个SNP位点的引物序列 Table 1 Primer sequences of two SNP sites of SP-A1
位点 正向引物序列 反向引物序列
rs1059047 5′ GCTCCTTACTCTTCCTCCTCCT 3′ 5′TAGTGAGACTCGATGCCCATTAT 3′
rs1136450 5′ GCTGTGTGCGAAGTGAAGGA 3′ 5′ TGAGGACAGACTCTCCAGGATG 3′

(3)PCR反应体系。模板DNA 20~50 ng/μL 1~2 μL, 引物F 10 μmol/L 2 μL, 引物R10 μmol/L 2 μL dNTP(mix)10 mmol/L 2 μL Taq Buffer(with MgCl2)10×5 μLTaq酶5 U/μL 0.5μL add ddH2O to 50 μL

(4)PCR反应条件。预变性95 ℃3~5 min,变性94 ℃,30 s,退火55~60 ℃25~30 s,延伸72 ℃30~50 s,循环2 to 4 35 cycles,修复延伸72 ℃5~8 min。

(5)电泳检测条带。PCR产物取5μL 1%琼脂糖凝胶电泳,电泳参数:150 V,100 mA,10~20 min电泳观察见图 1

图 1 电泳图(SP-A1等位基因经PCR扩增后在1%琼脂糖凝胶电泳上的表达) Fig 1 Electropherogram(expression of SP-A1 allele on 1% agarose gel electrophoresis after PCR amplification)
1.2.3 DNA目的片段的序列测定

PCR-SSCP技术检测SP-A1基因多态性取待测序样本及上下游引物各20 µL,干冰保存寄送至上海生工有限公司,分别用PCR基因多态性分析和SSCP对SP-A1 SNP位点(rs1059047、rs1136450)和等位基因单倍体(6A、6A2、6A3)基因进行检测,所得结果与Gen Bank基因库的正常序列进行对比判读,并用sequence analysis软件进行分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS19.0版本统计软件分析数据,计数资料以百分比或率表示,采用四格表χ2检验,计量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,采用成组t检验,以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

蒙古族RDS早产儿50例(男33例,女17例)为病例组,性别比率均衡,出生体质量960~2 830 g,胎龄28周~36周+6,剖宫产35例,肌注地塞米松促肺成熟45例。同民族、同性别、胎龄相近的非RDS早产儿50例(男29例,女21例)为对照组,出生体质量1 063~2 750 g,胎龄30周+1~36周+5,剖宫产28例,肌注地塞米松规律促肺成熟38例, 见表 2

表 2 RDS组与非RDS组患儿一般情况比较 Table 2 Comparison of general data of RDS group and non-RDS group
组别 例数 性别
(男/女)
胎龄
(Mean±SD, w)
出生体质量
(Mean±SD, g)
肌注地塞米松
(是/否)
病例组 50 33/17 32.15±1.90 1848.70±678 45/5
对照组 50 29/21 31.72±1.77 1630.46±482 38/12
χ2/t值 0.679 1.168 1.853 3.473
P 0.410 0.246 0.067 0.062
2.2 SNP位点的等位基因、等位基因频率及等位基因单倍体频率比较

RDS组rs1059047位点可检测出3种基因型CC、TT、CT,见(图 2),频率分别为14%、74%和12%,T等位基因频率为49%;C等位基因频率为51%;非RDS组3种基因型频率分别为16%、64%和20%,T等位基因频率为52%,C等位基因频率为48%;两组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.429,P > 0.05),见表 3;RDS组rs1136450位点可检测出2种基因型CG、GG,见(图 3)频率分别为76%、24%,C等位基因频率为38%,G等位基因频率为62%;非RDS组2种基因型频率分别为86%、14%,G等位基因频率为57%,C等位基因频率为43%;两组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.624,P > 0.05),见表 4;SP-A1单倍体6A、6A2、6A3的分布频率在RDS组分别为36%、68%、42%;在对照组分别为62%、46%、50%。两组间等位基因单倍体6A频率差异无统计学意义(χ2=0.502,P > 0.05);两组间等位基因单倍体6A、6A2频率差异有统计学意义(χ2=6.763、4.937,P < 0.05)。见表 5

图 2 SP-A1 rs1059047位点基因型 Fig 2 SP-A1 rs1059047 locus genotype

表 3 两组患儿rs1059047位点等位基因及基因型分布(例,%) Table 3 Distribution of alleles and genotypes of rs1059047 locus in the two groups (cases, %)
组别 例数 基因型频率 等位基因频率
CC TT CT C T
病例组 50 7(14) 37(74) 6(12) 51(51) 49(49)
对照组 50 8(16) 32(64) 10(20) 48(48) 52(52)
χ2 1.429 0.180
P 0.489 0.671

图 3 SP-A1 rs1136450位点基因型 Fig 3 SP-A1 of rs1136450 locus genotype

表 4 两组患儿rs1136450位点等位基因及基因型分布(例,%) Table 4 Distribution of alleles and genotypes of rs1136450 locus in the two groups (cases, %)
组别 例数 基因型频率 等位基因频率
CG GG C G
病例组 50 38(76) 12(24) 38(38) 62(62)
对照组 50 43(86) 7(14) 43(43) 57(57)
χ2 1.624 0.519
P 0.202 0.471

表 5 两组间等位基因单倍体分布(例,%) Table 5 Allelic haploid distribution between the two groups (case, %)
组别 例数 等位基因单倍体
6A 6A2 6A3
+ - + - + -
病例组 50 18 32 34 16 21 29
对照组 50 31 19 23 27 25 25
χ2 6.763 4.937 0.502
P 0.009 0.026 0.479
注:+表达,-未表达,以P < 0.05为差异有统计学意义
3 讨论

SP-A是相对分子质量为26 000~36 000 u的一种多聚体糖蛋白,为C-型凝集素蛋白家族的成员之一,成熟的SP-A含有248个氨基酸残基。人SP-A基因全长约4.5 kb,其编码基因位于第10号染色体长臂q2 1-q 23,含两个功能性基因(SP-A1和SP-A2)和一个假基因,两个功能基因SP-A1和SP-A2在氨基酸序列上具有高度的相似性,且两个基因之间存在着连锁不平衡的关系[8]。到目前已发现9种SP-A基因多态性位点,SP-A1基因的第19、50、62、133和219个密码子和SP-A2基因的第9、91、140、223个密码子均存在单核昔酸多态性位点,分别被命名为6An和1An。早期美国学者发现SP-A1和SP-A2单体型分别有19种及15种,其中SP-A1等位基因(6A,6A2,6A3,6A4,6A5)及SP-A2等位基因(1A, 1A0,1A2,1A3,1A5)为常见单体型[9]

研究发现早产儿RDS发病与SP-A基因多态性有相关性[10]。由于种族差异, SP-A等位基因的分布频率各人群中不相同[11-13],2000年芬兰的Remat等对88例患RDS和88例未患RDS早产儿进行病例对照研究发现, SP-A1等位基因6A3在病例组呈低表达,而6A2呈过表达,在胎龄 < 32周早产儿中这种关系更显著, 表明6A2为RDS的易感基因, 6A3为保护性基因。2001年Floros等[14]进行的家系传递不平衡检验和病例对照研究,家系传递不平衡检验发现从父母遗传给患RDS的孩子中6A2呈增加的趋势,病例对照研究发现不论是白种人或是黑种人6A2RDS中的表达均增高。本研究发现SP-A1单倍体等位基因6A2在RDS组呈过表达,表明6A2为蒙古族早产儿RDS的易感基因,与已有的研究结果一致,但本研究中6A3等位基因单倍体2组间表达差异无统计学意义,而6A等位基因单倍体在RDS组较非RDS组低表达,表明为保护性基因,与芬兰的研究结果不一致。但韩国学者发现SP-A1基因与早产儿发生RDS无相关性[15]。研究还发现,SP-A1 6A4单倍型是希腊晚期早产儿RDS的易感因素[16]。KaLa等[17]研究证明白种人早产儿患RDS与SP-A2等位基因1A0有相关性。还有研究发现SP-A(+186A/G)基因多态性与早产儿患RDS密切相关,SP-A、A2(AA)基因型是RDS危险因素[18]。以上研究表明SP-A1等位基因的分布频率存在不同种族和民族的特异性。本研究只对SP-A1进行研究,未对SP-A2进行研究,而且未划分胎龄界限,为本研究的不足之处。将在后续的研究工作中,进行SP-A2基因研究,更全面了解SP-A在蒙古族人群的分布特点及与早产儿RDS的相关性。

本研究发现SP-A1等位基因单倍体6A2为蒙古族早产儿RDS的易感基因,单倍体6A为保护基因;由于本研究样本量有限,本研究结果可能产生一定的偏倚,故还需大样本、多中心、严密设计的研究来进一步证实。

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