新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)是由肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)缺乏而导致,肺泡进行性萎陷而进行性呼吸困难和呼吸衰竭的临床综合征,是导致早产儿疾病与死亡最主要因素之一[1-2]。肺表面活性物质蛋白(pulmonary surfactant protein,SP)是由卵磷脂与PS结合的蛋白质, 包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D[3]。目前国内外较多研究发现SP-B、SP-C基因多态性与RDS发病率密切相关[4-5],国外一些研究发现早产儿RDS发病率与SP-A基因多态性有相关性[6]。目前国内翟亮等[7]研究发现SP-A等位基因单倍体型与早产儿发生RDS有相关性,但局限于两个等位基因单倍体型的小样本的研究。本研究以内蒙古西部地区蒙古族早产儿为研究对象,采用PCR-SSCP基因分析技术对SP-A1 SNP位点(rs1059047、rs1136450)和等位基因单倍体(6A、6A2、6A3)进行检测,分析SP-A1基因多态性与蒙古族早产儿发生RDS的相关性,可望发现蒙古族早产儿RDS的易感基因。
1 资料与方法 1.1 一般资料采用病例对照研究方法,病例组:①于2016年1月至2019年1月在内蒙古医科大学附属医院新生儿科住院治疗的蒙古族RDS早产儿50例;②RDS的诊断依据为欧洲颁布的RDS诊断标准[1]。对照组:①同时间段住院治疗的蒙古族非RDS早产儿50例;②普通胸片提示无肺部炎症和RDS表现;③血常规及CRP检查提示无感染者。病例对照组均排除:①遗传代谢性疾病患儿;②严重先天性疾病患儿;③生后重度窒息患儿;④母亲妊娠期糖尿病;⑤母亲孕期有明确感染史。
本研究经医院医学伦理委员会批准,血液样本采集均获得患儿家属知情同意。
1.2 方法 1.2.1 样本采集收集蒙古族早产儿RDS患儿的抗凝全血样1.0 mL;同时收集与RDS组患儿胎龄、体质量、性别相匹配的非RDS患儿抗凝全血样本1.0 mL,放置抗凝管(EDTAK2)抗凝,置于-80℃冰箱保存备用,同时收集病例组和对照组的临床资料。
1.2.2 基因组DNA的提取,浓度测定及PCR扩增(1)DNA提取。采用全血基因组DNA提取试剂盒的操作说明书进行基因组DNA提取;DNA质量检测:①取5 μL DNA溶液1%琼脂糖1×TAE缓冲溶液电泳(电压120~180 V)检测,单一条带说明DNA完整无降解,有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求;②分光光度计检测浓度和纯度,取1 μL检测A值,A260/280在1.7~2.0,说明DNA质量较好,小于1.7为有蛋白污染,大于2.0为有RNA污染,一般有少量的蛋白与RNA污染不影响普通PCR。
(2)引物设计。设计引物软件用Primer Premier 5,引物长度在18~30 bp;Tm值在55~65 ℃,退火温度要在60 ℃左右;GC含量40%~70%;避免连续4个碱基,尤其是G和C,3' 端最后5个碱基内最好不能有多于3个的G或C;PCR扩增产物长度:位点测序引物在150~300 bp左右,离位点80~150 bp,外显检测引物离外显子上下游150 bp左右;目的基因测序的PCR产物条带一般不超过1 200 bp。引物见表 1。
位点 | 正向引物序列 | 反向引物序列 |
rs1059047 | 5′ GCTCCTTACTCTTCCTCCTCCT 3′ | 5′TAGTGAGACTCGATGCCCATTAT 3′ |
rs1136450 | 5′ GCTGTGTGCGAAGTGAAGGA 3′ | 5′ TGAGGACAGACTCTCCAGGATG 3′ |
(3)PCR反应体系。模板DNA 20~50 ng/μL 1~2 μL, 引物F 10 μmol/L 2 μL, 引物R10 μmol/L 2 μL dNTP(mix)10 mmol/L 2 μL Taq Buffer(with MgCl2)10×5 μLTaq酶5 U/μL 0.5μL add ddH2O to 50 μL
(4)PCR反应条件。预变性95 ℃3~5 min,变性94 ℃,30 s,退火55~60 ℃25~30 s,延伸72 ℃30~50 s,循环2 to 4 35 cycles,修复延伸72 ℃5~8 min。
(5)电泳检测条带。PCR产物取5μL 1%琼脂糖凝胶电泳,电泳参数:150 V,100 mA,10~20 min电泳观察见图 1。
1.2.3 DNA目的片段的序列测定PCR-SSCP技术检测SP-A1基因多态性取待测序样本及上下游引物各20 µL,干冰保存寄送至上海生工有限公司,分别用PCR基因多态性分析和SSCP对SP-A1 SNP位点(rs1059047、rs1136450)和等位基因单倍体(6A、6A2、6A3)基因进行检测,所得结果与Gen Bank基因库的正常序列进行对比判读,并用sequence analysis软件进行分析。
1.3 统计学方法应用SPSS19.0版本统计软件分析数据,计数资料以百分比或率表示,采用四格表χ2检验,计量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,采用成组t检验,以P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况蒙古族RDS早产儿50例(男33例,女17例)为病例组,性别比率均衡,出生体质量960~2 830 g,胎龄28周~36周+6,剖宫产35例,肌注地塞米松促肺成熟45例。同民族、同性别、胎龄相近的非RDS早产儿50例(男29例,女21例)为对照组,出生体质量1 063~2 750 g,胎龄30周+1~36周+5,剖宫产28例,肌注地塞米松规律促肺成熟38例, 见表 2。
组别 | 例数 | 性别 (男/女) |
胎龄 (Mean±SD, w) |
出生体质量 (Mean±SD, g) |
肌注地塞米松 (是/否) |
病例组 | 50 | 33/17 | 32.15±1.90 | 1848.70±678 | 45/5 |
对照组 | 50 | 29/21 | 31.72±1.77 | 1630.46±482 | 38/12 |
χ2/t值 | 0.679 | 1.168 | 1.853 | 3.473 | |
P值 | 0.410 | 0.246 | 0.067 | 0.062 |
RDS组rs1059047位点可检测出3种基因型CC、TT、CT,见(图 2),频率分别为14%、74%和12%,T等位基因频率为49%;C等位基因频率为51%;非RDS组3种基因型频率分别为16%、64%和20%,T等位基因频率为52%,C等位基因频率为48%;两组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.429,P > 0.05),见表 3;RDS组rs1136450位点可检测出2种基因型CG、GG,见(图 3)频率分别为76%、24%,C等位基因频率为38%,G等位基因频率为62%;非RDS组2种基因型频率分别为86%、14%,G等位基因频率为57%,C等位基因频率为43%;两组间此位点基因型频率差异无统计学意义(χ2= 1.624,P > 0.05),见表 4;SP-A1单倍体6A、6A2、6A3的分布频率在RDS组分别为36%、68%、42%;在对照组分别为62%、46%、50%。两组间等位基因单倍体6A频率差异无统计学意义(χ2=0.502,P > 0.05);两组间等位基因单倍体6A、6A2频率差异有统计学意义(χ2=6.763、4.937,P < 0.05)。见表 5。
组别 | 例数 | 基因型频率 | 等位基因频率 | ||||
CC | TT | CT | C | T | |||
病例组 | 50 | 7(14) | 37(74) | 6(12) | 51(51) | 49(49) | |
对照组 | 50 | 8(16) | 32(64) | 10(20) | 48(48) | 52(52) | |
χ2值 | 1.429 | 0.180 | |||||
P值 | 0.489 | 0.671 |
组别 | 例数 | 基因型频率 | 等位基因频率 | |||
CG | GG | C | G | |||
病例组 | 50 | 38(76) | 12(24) | 38(38) | 62(62) | |
对照组 | 50 | 43(86) | 7(14) | 43(43) | 57(57) | |
χ2值 | 1.624 | 0.519 | ||||
P值 | 0.202 | 0.471 |
组别 | 例数 | 等位基因单倍体 | |||||||
6A | 6A2 | 6A3 | |||||||
+ | - | + | - | + | - | ||||
病例组 | 50 | 18 | 32 | 34 | 16 | 21 | 29 | ||
对照组 | 50 | 31 | 19 | 23 | 27 | 25 | 25 | ||
χ2值 | 6.763 | 4.937 | 0.502 | ||||||
P值 | 0.009 | 0.026 | 0.479 | ||||||
注:+表达,-未表达,以P < 0.05为差异有统计学意义 |
SP-A是相对分子质量为26 000~36 000 u的一种多聚体糖蛋白,为C-型凝集素蛋白家族的成员之一,成熟的SP-A含有248个氨基酸残基。人SP-A基因全长约4.5 kb,其编码基因位于第10号染色体长臂q2 1-q 23,含两个功能性基因(SP-A1和SP-A2)和一个假基因,两个功能基因SP-A1和SP-A2在氨基酸序列上具有高度的相似性,且两个基因之间存在着连锁不平衡的关系[8]。到目前已发现9种SP-A基因多态性位点,SP-A1基因的第19、50、62、133和219个密码子和SP-A2基因的第9、91、140、223个密码子均存在单核昔酸多态性位点,分别被命名为6An和1An。早期美国学者发现SP-A1和SP-A2单体型分别有19种及15种,其中SP-A1等位基因(6A,6A2,6A3,6A4,6A5)及SP-A2等位基因(1A, 1A0,1A2,1A3,1A5)为常见单体型[9]。
研究发现早产儿RDS发病与SP-A基因多态性有相关性[10]。由于种族差异, SP-A等位基因的分布频率各人群中不相同[11-13],2000年芬兰的Remat等对88例患RDS和88例未患RDS早产儿进行病例对照研究发现, SP-A1等位基因6A3在病例组呈低表达,而6A2呈过表达,在胎龄 < 32周早产儿中这种关系更显著, 表明6A2为RDS的易感基因, 6A3为保护性基因。2001年Floros等[14]进行的家系传递不平衡检验和病例对照研究,家系传递不平衡检验发现从父母遗传给患RDS的孩子中6A2呈增加的趋势,病例对照研究发现不论是白种人或是黑种人6A2RDS中的表达均增高。本研究发现SP-A1单倍体等位基因6A2在RDS组呈过表达,表明6A2为蒙古族早产儿RDS的易感基因,与已有的研究结果一致,但本研究中6A3等位基因单倍体2组间表达差异无统计学意义,而6A等位基因单倍体在RDS组较非RDS组低表达,表明为保护性基因,与芬兰的研究结果不一致。但韩国学者发现SP-A1基因与早产儿发生RDS无相关性[15]。研究还发现,SP-A1 6A4单倍型是希腊晚期早产儿RDS的易感因素[16]。KaLa等[17]研究证明白种人早产儿患RDS与SP-A2等位基因1A0有相关性。还有研究发现SP-A(+186A/G)基因多态性与早产儿患RDS密切相关,SP-A、A2(AA)基因型是RDS危险因素[18]。以上研究表明SP-A1等位基因的分布频率存在不同种族和民族的特异性。本研究只对SP-A1进行研究,未对SP-A2进行研究,而且未划分胎龄界限,为本研究的不足之处。将在后续的研究工作中,进行SP-A2基因研究,更全面了解SP-A在蒙古族人群的分布特点及与早产儿RDS的相关性。
本研究发现SP-A1等位基因单倍体6A2为蒙古族早产儿RDS的易感基因,单倍体6A为保护基因;由于本研究样本量有限,本研究结果可能产生一定的偏倚,故还需大样本、多中心、严密设计的研究来进一步证实。
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