2019, Vol. 28
急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指由多种病因引起的胰酶激活，导致胰腺组织的自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应，伴或不伴其他器官功能改变的疾病。急性胰腺炎临床严重程度与其预后转归相关，其中重症胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)预后差，其症状严重且病情变化快，可引起全身多器官功能的严重障碍，病死率可达30%[1]。炎症细胞及其细胞因子的过度激活学说是急性胰腺炎的主要发病机制之一，急性胰腺炎的病情发展和转归与机体的免疫状态密切相关[2-4]，研究免疫状态在不同临床严重程度的急性胰腺炎中的变化具有重要临床意义。
T淋巴细胞在免疫炎症反应中发挥重要作用，研究显示CD4+T细胞在胰腺炎的发病中发挥主要作用[5]，CD4+T比例下降与急性胰腺炎并发器官功能障碍相关[6-7]。Th1和Th2细胞是CD4+T淋巴细胞的主要亚群，Th1和Th2细胞在介导炎症性疾病发病中起关键作用[8-10]，两种细胞具有不同的免疫调节功能，Th1细胞特异性产生INF-γ，主要介导细胞免疫应答；Th2细胞特异性产生IL-4，主要介导体液免疫应答。
目前，关于Th1和Th2细胞在急性胰腺炎的炎症反应和免疫失调中的作用仍不完全清楚。本研究以不同临床严重程度急性胰腺炎患者为研究对象，通过检测急性胰腺炎患者发病后外周血中Th1、Th2细胞变化，并检测Th1、Th2细胞相关细胞因子表达水平，比较轻、中、重度急性胰腺炎及健康对照者Th1Th2细胞及其细胞因子变化，探讨其与急性胰腺炎临床严重程度的关系，为理解急性胰腺炎发生及在疾病进展中的机制和其免疫干预治疗策略提供依据。
1 资料与方法 1.1 一般资料前瞻性连续纳入2015年1月至2017年6月郑州大学第一附属医院急诊外科收治的72例急性胰腺炎患者为研究对象，按照2012年新的亚特兰大分类标准分为：（1）轻度急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组，无器官功能衰竭和局部及全身并发症；（2）中度重症急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）组，存在局部和（或）全身并发症和（或）短暂性器官功能衰竭（< 48 h）；（3）重度急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）组，有持续性器官功能衰竭（> 48 h），伴或不伴局部并发症。排除标准：（1）合并妊娠、免疫缺陷病、急慢性肝炎、终末期肝肾疾病、恶性肿瘤者及外伤者；（2）近3个月内使用激素或免疫抑制剂者；（3）慢性胰腺炎患者。对照组选取同期健康体检者30例（均无心、肝、肺、肾等重要脏器疾病，肝肾功能正常，均无肿瘤家族史）。本研究符合医学伦理学标准，并经医院伦理委员会批准，所有检测获得患者或家属知情同意。
1.2 外周血单个核细胞(PBMC)的分离入院24 h内无菌采集各组受试对象外周静脉血20 mL至乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝管中，Ficoll(Solarbio, 北京)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，纯化分离后的PBMCs经PBS洗涤并悬浮至补充10%胎牛血清和1%谷氨酰胺/青霉素/链霉素的淋巴细胞RPMI 1640培养基中备用。
1.3 流式细胞术检测Th1和Th2细胞采用流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞不同细胞亚群Th1、Th2细胞数量，其中Th1定义CD4+ IFN-γ+表达阳性细胞，Th2定义为CD4+ IL-4+表达阳性细胞。Th1细胞和Th2细胞的标记采用BD公司Th1/Th2/Th17试剂盒（BD Pharmingen, San Diego, CA）进行，其中抗CD4抗体偶联PerCP-Cy5.5, 抗IFN-γ抗体偶联FITC，抗IL-4抗体偶联APC，具体操作步骤按照说明书进行。应用流式细胞仪（FACSCalibur，BD）检测经抗CD4抗体偶联PerCP-Cy5.5, 抗IFN-γ抗体偶联FITC，抗IL-4抗体偶联APC的抗体孵育的PBMCs细胞，采用流式细胞软件Cell Quest (BD Biosciences)软件对检测结果进行分析Th1、Th2细胞占CD4+T细胞的数量比例。
1.4 ELISA检测法检测Th1和Th2细胞相关细胞因子采用ELISA技术测定血清Th1细胞相关的炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-2表达水平和Th2细胞相关的炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的表达水平，试剂盒购于R & D公司，具体操作步骤按照说明书进行。
1.5 统计学方法采用SPSS 16.0进行统计学分析，Shapiro-Wilk（S-W）方法进行数据正态性检验，Levene检验方法分析数据方差齐性。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（P25, P75）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。计数资料以频数和百分率（n, %）表示，组间比较采用卡方检验。以Pearson线性相关进行相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 三组急性胰腺炎患者的临床特征按照纳入标准共纳入72例郑州大学第一附属医院急诊外科患者，其中轻度急性胰腺炎（MAP）患者31例（43%），中度急性胰腺炎（MSAP）患者23例（32%），重度急性胰腺炎（SAP）患者18例（25%）。急性胰腺炎发病病因中，63.9%患者为胆结石，9.7%为酒精性，腹腔镜逆行胰胆管造影术所致占2.8%，混合性（酒精性和胆源性）占11.1%，代谢性因素占2.8%，药物诱导占1.4%，特发性胰腺炎占8.3%，各组发病原因差异无统计学意义。MAP组内科合并症中3例伴发高血压，2例患者伴发冠心病，1例患者伴发糖尿病。MSAP组内科合并症中1例伴发高血压，1例患者伴发冠心病，2例患者伴发糖尿病。SAP组内科合并症中2例伴发糖尿病，1例伴发冠心病，无高血压患者。本研究所有纳入的72例研究对象没有使用免疫抑制剂。经统计学分析，两组患者在年龄、性别、种族等人口学资料，发病原因，体质量指数，内科合并症间差异无统计学意义，见表 1。
| 指标 | MAP组 (n=31) |
MSAP组 (n=23) |
SAP组 (n=18) |
对照组 (n=30) |
F/χ2值 | P值 |
| 年龄 （岁, Mean±SD） |
46.29±11.24 | 49.09±12.73 | 48.77±12.96 | 47.83±9.89 | 0.307 | 0.820 |
| 性别（例，%） | 0.789 | 0.852 | ||||
| 男 | 14(45.1) | 11(47.8) | 8(44.4) | 12(40) | ||
| 女 | 17(54.9) | 12 (52.2) | 10(55.6) | 18(60) | ||
| BMI （kg/m2, Mean±SD） |
26.14±3.77 | 26.56±4.79 | 26.05±6.16 | 26.75±5.18 | 0.114 | 0.952 |
| 种族（例，%） | 2.063 | 0.560 | ||||
| 汉族 | 28(90.3) | 22(95.7) | 18(100.0) | 28(93.3) | ||
| 少数民族 | 3(9.7) | 1(4.3) | 0(0.0) | 2(6.7) | ||
| 病因（例，%） | 4.722 | 0.967 | ||||
| 胆源性 | 20(64.6) | 15(65.2) | 11（61.2） | 0(0.0) | ||
| 酒精性 | 3(9.7) | 2(8.6) | 2（11.1） | 0(0.0) | ||
| ERCP术 | 1(3.2) | 0(0) | 1（5.5） | 0(0.0) | ||
| 代谢性 | 1(3.2) | 1(4.3) | 0（0） | 0(0.0) | ||
| 混合性（酒精+结石） | 2(6.4) | 3(13.0) | 3(16.7) | 0(0.0) | ||
| 药物性 | 1(3.2) | 0(0) | 0(0) | 0(0.0) | ||
| 特发性 | 3(9.7) | 2(8.6) | 1(5.5) | 0(0.0) | ||
| 内科并发症（例，%） | ||||||
| 高血压 | 3(9.7) | 1(4.3) | 0(0.0) | 0(0.0) | 3.241 | 0.290 |
| 糖尿病 | 1(3.2) | 2(8.7) | 2(11.1) | 0(0.0) | 4.895 | 0.075 |
| 冠心病 | 2(6.5) | 1(4.3) | 1(5.6) | 0(0.0) | 2.648 | 0.508 |
| 注：正态分布计量资料以均数±标准差表示，分类变量以例数百分比表示；BMI，体质量指数；ERCP，内镜逆行胰胆管造影术 | ||||||
MAP组、MSAP组和SAP组Th1细胞数量在发病后均较健康对照组上升，组间差异有统计学意义，其中SAP组Th1细胞较MAP组和MSAP组显著升高，MAP组和MSAP组之间差异无统计学意义。此外，MAP组、MSAP组和SAP组Th2细胞数量在发病后均较健康对照组上升，组间差异具有统计学意义，SAP组Th2细胞数量较MAP组和MSAP组显著下降，MAP组和MSAP组之间差异无统计学意义。急性胰腺炎患者Th1和Th2细胞发病后数量变化见表 2。
| 细胞 | 健康对照组 | MAP组 | MSAP组 | SAP组 | F值 | P值 |
| Th1细胞 | 11.9±1.7 | 15.2±1.4a | 14.3±1.2a | 17.1±1.9abc | 11.137 | < 0.01 |
| Th2细胞 | 3.3±1.5 | 7.7±1.9a | 7.5±2.0a | 5.5±1.1abc | 9.493 | < 0.01 |
| 注：与健康对照组比较，aP < 0.05；与MAP组比较，bP < 0.05;与MSAP组比较，cP < 0.05 | ||||||
在探明急性胰腺炎患者Th1、Th2细胞数量变化的基础上，本研究进一步检测了急性胰腺炎患者入院时Th1细胞相关的炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-2表达水平和Th2细胞相关的炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的表达水平，以明确炎症因子在急性胰腺炎发病过程中的作用。本研究所测炎症因子浓度经自然对数转换以后符合正态分布，如表 3所示：（1）Th1细胞相关炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-2和Th2细胞相关的炎症因子IL-4在各组急性胰腺炎患者中表达水平均显著高于健康对照组，差异具有统计学意义。（2）IFN-γ血清水平SAP组和MSAP组高于MAP组，差异具有统计学意义，SAP组和MSAP组之间差异无统计学意义。（3）TNF-α血清水平SAP组高于MSAP和MAP组，差异具有统计学意义，MSAP组和MAP组之间差异无统计学意义。（4）IL-4表达水平SAP组显著低于MAP组和MSAP组，MAP和MSAP组间差异无统计学意义。（5）MAP组、MSAP组和SAP组之间IL-2、IL-5和IL-13的表达差异无统计学意义。
| LN(炎症因子) | 健康对照组 | MAP组 | MSAP组 | SAP组 | F值 | P值 |
| LN（IFN-γ） | 0.39±0.69 | 1.46±0.87a | 2.12±1.05ab | 2.56±0.41ab | 8.605 | 0.001 |
| LN（TNF-α） | 0.42±0.76 | 1.36±0.76a | 1.63±0.74a | 2.88±0.61ac | 11.847 | 0.000 |
| LN（IL-2） | -0.02±0.84 | 0.88±0.61a | 0.99±0.65a | 1.06±0.21a | 3.801 | 0.026 |
| LN（IL-4） | 0.89±0.85 | 2.36±0.37a | 2.10±0.46a | 1.62±0.38ac | 8.042 | 0.001 |
| LN（IL-5） | 0.34±1.09 | 0.04±1.22 | 0.42±1.12 | 0.37±1.10 | 0.136 | 0.937 |
| LN（IL-13） | 0.95±0.75 | 1.07±0.73 | 1.23±0.66 | 1.10±0.73 | 0.153 | 0.926 |
| 注：因数据经对数变换，部分数据显示为负值; 与健康对照组比较，aP < 0.05；与MAP组比较，bP < 0.05;与MSAP组比较，cP < 0.05 | ||||||
此外本研究发现，Th1细胞相关炎症因子IFN-γ表达水平与患者住院天数和ICU住院时间呈正相关，TNF-α的表达水平与患者住院天数呈正相关，Th2细胞相关炎症因子IL-4表达水平与患者住院天数和ICU住院时间呈负相关（表 4）。
| LN(炎症因子) | 总住院时间 | ICU住院时间 | |||
| r值 | P值 | r值 | P值 | ||
| LN（IFN-γ） | 0.569 | 0.014a | 0.538 | 0.021a | |
| LN（TNF-α） | 0.475 | 0.046a | 0.369 | 0.132 | |
| LN（IL-2） | 0.224 | 0.371 | 0.156 | 0.535 | |
| LN（IL-4） | -0.577 | 0.012a | -0.657 | 0.003a | |
| LN（IL-5） | 0.156 | 0.538 | 0.245 | 0.327 | |
| LN（IL-13） | 0.079 | 0.756 | 0.106 | 0.675 | |
| 注：aP < 0.05 | |||||
Th1和Th2细胞具有不同的免疫调节功能，Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等促炎因子，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等抗炎因子。研究发现Th1细胞持续性强应答，可能与器官特异性自身免疫病、不明原因的慢性炎症性疾病、迟发型超敏反应等有关，过度的Th2细胞应答可能在遗传易感的过敏性特应症中起重要作用。Th1和Th2亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1和Th2细胞与多种疾病的发生、发展和预后有着密切关系。
研究表明急性胰腺炎时Th1细胞分泌炎症因子，致使胰腺腺泡细胞受损，受损的腺泡细胞释放炎症因子再反馈作用于Th1细胞，加剧急性胰腺炎的炎症进展[11-12]。此外，新近研究表明，Th1和Th2细胞在急性胰腺炎疾病发展过程中发挥不同作用[13]。研究Th1细胞和Th2细胞与急性胰腺炎临床严重程度的关系具有重要意义。
本研究发现轻度、中度和重度急性胰腺炎患者Th1和Th2细胞均较健康对照组上升，Th1细胞相关促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-2和Th2细胞相关的抗炎因子IL-4在各组急性胰腺炎患者中表达水平均显著高于健康对照组，本研究的发现表明Th1细胞和Th2细胞通过细胞依赖性和细胞因子依赖性两条途径参与急性胰腺炎发病过程，证实免疫反应改变在急性胰腺炎发病中具有重要作用。
本研究发现SAP患者中Th1细胞数量较MAP及MSAP患者上升更明显，MAP及MSAP患者Th2细胞较SAP患者上升更显著。Th1相关细胞因子IFN-γ和TNF-α血清水平重度组高于MAP和MSAP组，Th2相关细胞因子IL-4表达水平SAP组显著低于MAP和MSAP组。Th1细胞相关炎症因子IFN-γ表达水平与患者住院天数和ICU住院时间呈正相关，TNF-α的表达水平与患者住院天数呈正相关，Th2细胞相关炎症因子IL-4表达水平与患者住院天数和ICU住院时间呈负相关, 提示Th1细胞相关免疫反应是加重急性胰腺炎发展过程的重要因素，Th2细胞可能在急性胰腺炎发展过程中具有保护作用。
SAP患者血清中Th1细胞相关细胞因子IFN-γ，TNF-α和IL-2较健康对照组上升，IFN-γ，TNF-α较MSAP患者增高，此发现与Rodriguez-Nicolas等[13]的研究结果一致，并且与既往研究促炎因子在急性胰腺炎的发病机制中起损害作用一致[14-15]。IFN-γ，TNF-α可以刺激B细胞产生抗体、激活巨噬细胞和CD8+T细胞，促进细胞介导的免疫和细胞毒性T细胞反应[16]，并可诱导Th1细胞分化，抑制Th2细胞增殖，IL-2则可同时引起Th1和Th2细胞增殖，下调APC和Th1细胞活性，在诱导免疫耐受中起重要作用。结合已有研究发现，本研究结果提示Th1细胞参与急性胰腺炎的发病，尤其是倾向于重度急性胰腺炎的发展过程，其机制一方面可能通过Th1细胞转移至胰腺通过细胞间相互作用而参与其发病；另一方面通过释放Th1相关炎症因子促进急性胰腺炎的病理生理过程。
目前，国内外研究多集中在促炎因子对急性胰腺炎的发展影响，但对抗炎因子在急性胰腺炎发病机制中的关注较少。本研究发现Th2相关细胞因子IL-4表达水平重度组显著低于轻度和中重度组，且Th2细胞相关炎症因子IL-4表达水平与患者住院天数和ICU住院时间呈负相关。已有研究表明IL-4诱导Th2细胞分化，可与IL-13等一起抑制Th1细胞功能，提示Th2细胞参与急性胰腺炎的发病，倾向于轻度和中重度急性胰腺炎的发展过程，可能在急性胰腺炎发展过程中具有保护作用，倾向于延缓急性胰腺炎的发展。
本研究发现Th1和Th2细胞在急性胰腺炎发病时的特征：Th1和Th2细胞在急性胰腺炎患者中增高，Th1促炎细胞因子IFN-γ，TNF-α和Th1细胞数量的增高倾向于加重急性胰腺炎发展过程，Th2细胞数量增高和抗炎细胞因子IL-4与更好的预后相关。急性胰腺炎是一种典型的炎性损伤疾病，Th1与Th2细胞参与其发病过程并与疾病严重程度相关，本研究为急性胰腺炎的靶向免疫调节治疗提供了依据。
作者贡献声明 王万朋和张岩为共同第一作者。王万朋和张岩共同负责实验操作和论文书写；王万朋完成血清收集、流式细胞仪检测；张岩完成ELISA检测和临床数据收集；刘海燕负责纳入研究对象；朱长举负责试验设计和数据分析
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