2019, Vol. 28
脓毒症是机体对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症是一种全身炎症性疾病，其本质是促炎和抗炎反应失衡，导致过度性、失控性炎症反应[2]，病原体或其产物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在这一过程中发挥重要作用。大麻素2型受体(cannabinoid receptor 2，CB2R)属于G蛋白偶联受体，主要表达在免疫细胞中[3]。研究表明，激活CB2R具有抗炎和免疫抑制作用[4]。CB2R激动剂作为抗炎药物在治疗多种疾病，如帕金森病、肠道疾病和心血管疾病中具有潜在的应用价值[5-7]。这些研究发现使CB2R进一步成为脓毒症治疗的新靶点，为脓毒症治疗带来新希望。自噬是进化中高度保守的细胞内降解过程，自噬通过清除病原体、控制炎症和调节免疫介质分泌参与免疫调节过程[8-9]。本研究拟探讨激活大麻素2型受体在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子分泌中的作用及其可能机制。
1 材料和方法 1.1 主要材料与试剂鼠源巨噬细胞RAW264.7细胞株（中科院典藏委员会细胞库）；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）(南美Gibco公司)；LPS（美国Sigma公司）；HU308（美国APExBIO公司)；3-甲基腺苷（美国Medchem Express公司)；ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）；逆转录试剂盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒（日本TOYOBO公司）；CFX ConnectTM荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；PBS、Marker和一抗稀释液（上海碧云天生物科技有限公司）；兔抗鼠LC3多克隆抗体（英国Abcam公司）；兔抗鼠Beclin1多克隆抗体和内参β-actin多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；BCA法蛋白浓度检测试剂盒、HPR标记的山羊抗兔IgG和增强型ECL发光试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司），荧光定量PCR引物由武汉天一辉远基因科技有限公司合成。
1.2 巨噬细胞RAW264.7培养巨噬细胞RAW264.7购自中科院典藏委员会细胞库。复苏后加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，倒置显微镜下观察，待细胞培养至80%左右融合时，吸弃培养液，用PBS冲洗2次。用细胞刮轻轻将细胞刮下，反复轻柔吹打，形成单细胞悬液，计数后按1:3比例传代，用于实验。
1.3 实验分组及处理将细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔板（2 mL/孔）中，采用随机数字表法，将其分为4组（n=6）：对照组（C组）、脂多糖组（LPS组）、脂多糖+CB2R激动剂HU308组(LPS+HU308组)、脂多糖+CB2R激动剂HU308+3-甲基腺苷组(LPS+HU308+3-MA组)。LPS组、LPS+HU308组和LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为1 μg/mL的LPS，孵育15 min时，LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为10 mmol/L的3-甲基腺苷，继续孵育15 min，LPS+HU308组和LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为10 µmol/L的HU308孵育24 h。
1.4 细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度取出加入各处理因素后的6孔板，每组取6个培养孔，取细胞培养上清液到干净离心管中，4℃、3 000 r/min，离心20 min，小心收集上清液，分装入冻存管，-80℃冰箱保存。严格按照酶联免疫吸附试剂盒说明书上的步骤进行操作，用酶标仪在450 nm波长处检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β）、白细胞介素-18（interleukin-18）的吸光度(OD)值，计算出标准曲线和回归方程，将样品吸光度值代入标准曲线，计算出样品中细胞因子的蛋白浓度。
1.5 细胞中ICAM-1和NLRP3 mRNA的表达水平收取各组细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒进行cDNA合成，具体操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行；反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行定量检测。以GAPDH为内参。内参GAPDH上游引物：TGGAAGGACTCATGACCACA，下游引物：TTCAGCTCAGGGATGACCTT。ICAM-1上游引物：GTGATGCTCAGGTATCCATCCA，下游引物：CACAGTTCTCAAAGCACAGCG。NLRP3上游引物：ATTACCCGCCCGAGAAAGG，下游引物：TCGCAGCAAAGATCCACACAG。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒说明书进行操作，采用20 μL体系进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。CFX ConnectTM荧光定量PCR仪进行扩增并分析处理数据。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。
1.6 LC3和Beclin1的表达水平收取各组细胞，加入组织蛋白裂解液和磷酸酶抑制剂，冰上裂解30 min，4℃、14 000 r/min，离心10 min，取上清液，BCA法进行蛋白浓度测定，采用Western blot法测定LC3和Beclin1的表达水平。加入5倍上样缓冲液，煮沸变性，取40 μg蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入β-actin（稀释比1：1 000）、LC3（稀释比1：1 000）和Beclin1（稀释比1：1 000）一抗，4℃摇床孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶（HPR）标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比1：10 000），室温摇床上孵育2 h，洗膜后ECL发光A、B显影剂按照1:1比例混匀后滴加在膜上，显影曝光。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定条带灰度值，以目的蛋白灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平，并计算LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）。
1.7 统计学方法采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，各组方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组细胞上清液中炎症因子浓度与C组比较，LPS组TNF-α[(228.86±10.20) pg/mL vs (140.05±5.54) pg/mL]、IL-1β[(363.62±8.14) pg/mL vs (244.82±9.11) pg/mL]和IL-18[(293.28±13.57) pg/mL vs (202.84±9.54) pg/mL]的浓度升高(均P＜0.05)；与LPS组比较，LPS+HU308组TNF-α[(165.44±7.07) pg/mL]、IL-1β[(272.09±3.35) pg/mL]和IL-18[(220.41±6.01) pg/mL]的浓度降低(均P＜0.05)；与LPS+HU308组比较，LPS+HU308+3-MA组TNF-α[(197.06±5.59) pg/mL]、IL-1β[(318.98±11.54) pg/mL]和IL-18[(243.33±8.71) pg/mL]的浓度升高(均P＜0.05)。见表 1。
| 组别 | TNF-α(pg/mL) | IL-1β(pg/mL) | IL-18(pg/mL) |
| C组 | 140.05±5.54 | 244.82±9.11 | 202.84±9.54 |
| LPS组 | 228.86±10.20a | 363.62±8.14a | 293.28±13.57a |
| LPS+HU308组 | 165.44±7.07ab | 272.09±3.35ab | 220.41±6.01ab |
| LPS+HU308+3-MA组 | 197.06±5.59abc | 318.98±11.54abc | 243.33±8.71abc |
| F值 | 224.507 | 246.856 | 114.374 |
| 注：与C组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LPS+HU308组比较，cP＜0.05 | |||
与C组比较，LPS组ICAM-1[(5.88±0.32) vs (1.00±0.03)]和NLRP3[(8.07±0.93) vs (1.01±0.05)] mRNA表达升高(均P＜0.05)；与LPS组比较，LPS+HU308组ICAM-1[(3.21±0.35)]和NLRP3[(1.54±0.30)] mRNA表达降低(均P＜0.05)；与LPS+HU308组比较，LPS+HU308+3-MA组ICAM-1[(4.04±0.21)]和NLRP3 [(5.87±0.77)] mRNA表达升高(均P＜0.05)。见表 2。
| 组别 | ICAM-1 | NLRP3 | LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ | Beclin1 |
| C组 | 1.00±0.03 | 1.01±0.05 | 0.40±0.06 | 0.16±0.03 |
| LPS组 | 5.88±0.32a | 8.07±0.93a | 0.50±0.03a | 0.51±0.04a |
| LPS+HU308组 | 3.21±0.35ab | 1.54±0.30ab | 0.71±0.03ab | 0.71±0.02ab |
| LPS+HU308+3-MA组 | 4.04±0.21abc | 5.87±0.77abc | 0.44±0.08c | 0.32±0.03abc |
| F值 | 361.852 | 179.871 | 41.020 | 424.451 |
| 注：与C组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LPS+HU308组比较，cP＜0.05 | ||||
与C组比较，LPS组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值[(0.50±0.03) vs (0.40±0.06)]和Beclin1[(0.51±0.04) vs (0.16±0.03)]表达上调(均P＜0.05)；与LPS组比较，LPS+HU308组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值[(0.71±0.03)]和Beclin1[(0.71±0.02)]表达上调(均P＜0.05)；与LPS+HU308组比较，LPS+HU308+3-MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值[(0.44±0.08)]和Beclin1[(0.32±0.03)]表达下调(均P＜0.05)。见表 2。
3 讨论LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分，通过诱导产生多种促炎介质激活细胞因子网络，诱导炎症反应[10]。巨噬细胞是抵抗病原体入侵的第一道防线，在炎症反应的早期被激活[11]，LPS感染后刺激巨噬细胞产生炎症介质如IL-1β、IL-6和TNF-α等。目前使用LPS刺激巨噬细胞的模型已被广泛应用于评估抗炎药物的效应[10]。细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM- 1)是I型跨膜糖蛋白，是介导黏附反应重要的一个黏附分子，具有重要的信号传导特性，与许多细胞反应如细胞黏附、迁移和聚集有关[12]。NLRP3是NOD (nucleotide binding oligomerization domain)样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NOD-like receptors)，与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)和半胱天冬酶1(caspase1)组成NLRP3炎症小体，参与多种疾病的发生发展过程[13]。NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组分，能被多种病原体或危险信号所激活，通过诱导分泌促炎性细胞因子IL-1β和IL-18发挥炎症作用[14]。研究表明NLRP3炎症小体参与了脓毒症的炎症反应过程[15]。
本研究使用终浓度为1 μg/mL的LPS刺激巨噬细胞，参考文献[16]选择CB2R激动剂HU308的浓度为10 μmol/L，结果表明，与C组比较，LPS组细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18表达升高，ICAM-1 mRNA表达上调，提示LPS刺激后巨噬细胞分泌炎症因子增加。与LPS组相比，LPS+HU308组细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18表达下降，ICAM-1 mRNA表达下调，提示激活CB2R可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的分泌。
微管相关蛋白1轻链3(LC3)是酵母Atg8的同系物，细胞内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例与自噬体的数量成正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性[17]。Beclin1基因也称BECN1基因，是酵母Atg 6的同系物，Beclin1可与Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶形成复合物参与自噬体的形成，是自噬起始的重要调节因子。本研究结果表明，与LPS组相比，LPS+HU308组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达上调，NLRP3 mRNA表达降低，提示激活CB2R可提高巨噬细胞自噬水平同时抑制NLRP3的表达。
本研究使用了自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-Methyladenine, 3-MA），参考文献[18]选择药物浓度为10 mmol/L。结果表明，给予3-MA后HU308抑制炎症因子分泌的作用减弱，同时NLRP3 mRNA表达升高，提示激活CB2R抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子分泌的机制可能与自噬水平增强和抑制NLRP3表达有关。研究发现，CB2R激动剂HU308通过增强自噬水平，抑制NLRP3的活化，减轻结肠炎和脑脊髓膜炎炎症反应。且越来越多的证据表明自噬可以通过清除损伤的线粒体，减少活性氧ROS和线粒体DNA的产生，抑制NLRP3炎症小体的活化，从而减少炎症因子的产生[22-25]。因此激活CB2R抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的分泌的机制是否与增强自噬从而抑制NLRP3炎症小体活化有关，仍需进一步探讨。
| [1] | Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3)[J]. JAMA, 2016, 315(8): 801-810. DOI:10.1001/jama.2016.0287 |
| [2] | 张卉, 冯永文, 姚咏明. 自噬在脓毒症免疫反应中的潜在作用与意义[J]. 中华急诊医学杂志, 2019, 28(2): 131-134. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.02.001 |
| [3] | Marzo VD, Bifulco M, Petrocellis LD. The endocannabinoid system and its therapeutic exploitation[J]. Nat Rev Drug Discov, 2004, 3(9): 771-784. DOI:10.1038/nrd1495 |
| [4] | Zhou J, Burkovskiy I, Yang H, et al. CB2 and GPR55 receptors as therapeutic targets for systemic immune dysregulation[J]. Front Pharmacol, 2016, 7: 264. DOI:10.3389/fphar.2016.00264 |
| [5] | Shi J, Cai Q, Zhang JX, et al. AM1241 alleviates MPTP-induced Parkinson's disease and promotes the regeneration of DA neurons in PD mice[J]. Oncotarget, 2017, 40(8): 67837-67850. DOI:10.18632/oncotarget.18871 |
| [6] | Leinwand KL, Jones AA, Huang RH, et al. Cannabinoid receptor-2 ameliorates inflammation in murine model of crohn's disease[J]. J Crohn's Colitis, 2017, 11(11): 1369-1380. DOI:10.1093/ecco-jcc/jjx096 |
| [7] | Sierra S, Luquin N, Navarro-Otano J. The endocannabinoid system in cardiovascular function: novel insights and clinical implications[J]. Clin Auton Res, 2018, 28(1): 35-52. DOI:10.1007/s10286-017-0488-5 |
| [8] | 葛赟, 黄曼, 马岳峰. 自噬在脓毒症发生发展中作用的研究进展[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(11): 1330-1333. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2017.11.022 |
| [9] | Deretic V, Saitoh T, Akira S. Autophagy in infection, inflammation and immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(10): 722-737. DOI:10.1038/nri3532 |
| [10] | Gui H, Sun Y, Luo ZM, et al. Cannabinoid receptor 2 protects against acute experimental sepsis in mice[J]. Med Inflam, 2013, 2013: 1-10. DOI:10.1155/2013/741303 |
| [11] | Wang LQ, Jing JZ, Yan H, et al. Selenium pretreatment alleviated LPS-induced immunological stress via upregulation of several selenoprotein encoding genes in murine RAW264.7 cells[J]. Biol Trace Elem Res, 2018, 186(2): 505-513. DOI:10.1007/s12011-018-1333-y |
| [12] | Woodfin A, Beyrau M, Voisin MB, et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia[J]. Blood, 2016, 127(7): 898-907. DOI:10.1182/blood-2015-08-664995 |
| [13] | Nakahira K, Haspel JA, Rathinam VAK, et al. Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome[J]. Nat Immunol, 2011, 12(3): 222-230. DOI:10.1038/ni.1980 |
| [14] | Zhou WY, Chen CY, Chen ZH, et al. NLRP3: A novel mediator in cardiovascular disease[J]. J Immun Res, 2018, 2018: 1-8. DOI:10.1155/2018/5702103 |
| [15] | Liu Y, Jing YY, Zeng CY, et al. Scutellarin suppresses NLRP3 inflammasome activation in macrophages and protects mice against bacterial sepsis[J]. Front Pharmacol, 2018, 8: 975. DOI:10.3389/fphar.2017.00975 |
| [16] | Jiang LS, Chen YM, Huang XJ, et al. Selective activation of CB2 receptor improves efferocytosis in cultured macrophages[J]. Life Sciences, 2016, 161: 10-18. DOI:10.1016/j.lfs.2016.07.013 |
| [17] | Klionsky DJ. Coming soon to a journal near you: The updated guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J]. Autophagy, 2014, 10(10): 1691. DOI:10.4161/auto.36187 |
| [18] | Miller S, Oleksy A, Perisic O, et al. Finding a fitting shoe for Cinderella[J]. Autophagy, 2010, 6(6): 805-807. DOI:10.4161/auto.6.6.12577 |