脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍综合征，由宿主对感染反应失调引起，是进入重症监护病房(ICU)的主要原因之一。过去十年间，在一些高收入国家，ICU住院病死率高达17%^[1-2]。研究发现，脓毒症中存在血管内皮细胞屏障功能的下降或丧失，导致循环物质（如体液和炎症因子等）移位，是引起循环血容量下降、组织器官水肿和损伤的重要因素^[3]。血管内皮细胞屏障功能破坏可能是脓毒症和脓毒症引起的多器官功能障碍的核心，在脓毒症进展过程中，内皮细胞发生活化，产生大量促炎因子，使内皮细胞损伤甚至凋亡^[4-5]。血管内皮细胞凋亡可引起微血管功能障碍，直接导致脓毒症患者器官衰竭^[6]。LPS作为革兰阴性菌的组成部分，是一种炎症刺激因子，其通过刺激血管内皮细胞，诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）凋亡相关因子表达^[7]。因此, 通过抑制LPS介导的血管内皮细胞凋亡对脓毒症治疗的研究具有重要意义。

环木菠萝甾醇阿魏酸酯（cycloartenyl ferulate，CF）是一种存在于谷粒外皮内的天然生物活性物质^[8]。研究显示，CF具有较好的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用^[9]。笔者前期的研究也表明，CF可以明显拮抗百草枯（PQ）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡，并能明显减少PQ在HK-2细胞内蓄积，对PQ诱导的HK-2生长抑制产生逆转作用^[10]。本研究以HUVECs为研究对象，评估CF对LPS诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制, 旨在为CF的开发利用提供科学依据。

HUVECs购于美国ATCC；CF标准品购自日本Wako公司；The Cell Counter Kit-8 (CCK-8)购自日本同仁化学研究所；Nrf2、血红素氧合酶-1 (HO-1)、caspase-3和β-actin抗体购自Cell Signaling Technololgy；Bcl-2和Bax抗体购自abcam公司；内皮细胞专用培养基购自美国Sciencell公司；原位末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡测试盒购于Roche公司。

HUVECs培养于5% CO₂的37℃饱和湿度培养箱中，采用含10% FBS及1%青霉素、链霉素和内皮细胞生长因子的内皮细胞培养基，待细胞生长至80%~90%融合后，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1:2~1:4传代培养，并根据细胞生长情况及时换液。取处于对数期、生长状况良好的细胞进行实验。

HUVECs以适当密度接种, 实验前用含1% FBS的培养液饥饿HUVECs 12 h后加入不同剂量的CF和(或) 10 µg/L的LPS, 于含10% FBS的DMEM培养液中继续培养12 h。实验分为正常组、CF组、LPS组和LPS+CF不同剂量(80、160、320 µmol/L)组。

将消化后的细胞以5×10³个/孔的密度，接种到96孔板中, 经相应的药物处理12 h后，将旧培养基弃去，用PBS洗一遍，吸尽残余液体，各孔加入含10 µL CCK-8的培养基100 µL孵育2 h。使用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度值（A），计算细胞的相对存活率。每组设置3个重复孔并取其平均数，同时设置只添加培养基而不加HUVECs的单孔作为空白对照。细胞存活率（%）=[A_加药-A_空白]/[A_未加药-A_空白] ×100%。

HUVECs以2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板，6组HUVECs在上述分组处理后，置于培养箱中培养，12 h后取出培养板吸净上清液，加入含PMSF和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液40 µL，于冰上充分裂解20 min后超声破碎，并于4℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清液进行蛋白定量，取30 µg蛋白样品进行电泳转膜后封闭，与一抗4℃孵育过夜后洗膜，在室温孵育二抗1 h，洗膜后用化学发光（ECL）法显影，选用β-actin做为内参，以各目的蛋白的灰度值与相对应β-actin的灰度值比值进行统计分析。

细胞分组及处理如上述，在4%多聚甲醛固定细胞后，用0.1%Tritonx-100在室温中通透细胞2 min，PBS漂洗3遍后在爬片上滴加TUNEL检测液，并避光孵育60 min。DAPI复染后封片在荧光显微镜下观察。

采用SPSS 23.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较用LSD-t检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

如图 1A所示，分别用0.01、0.1、1、10、100 µg/mL的LPS刺激HUVEC 12 h，发现0.01 µg/mL的LPS刺激后HUVECs存活率没有明显下降(P > 0.05)。随着LPS浓度增加，HUVECs存活率逐渐下降，其中浓度为10 µg/mL LPS作用于HUVECs 12 h后，细胞存活率为（68.3±2.43）%，存活率明显下降(F=5.466, P < 0.05)。检测单纯CF对HUVEC存活率的影响时，HUVEC存活率均大于90%，与正常组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），CF不显示细胞毒性，见图 1B。

与空白对照组比较，aP < 0.05；n=5 图 1 LPS及CF对HUVEC存活率的影响 Fig 1 Effect of LPS and CF on survival rate of HUVEC

图选项

如图 2所示，10 µg/mL的LPS作用HUVECs 12 h，与空白对照组相比，细胞的生长明显受到抑制。而同时给予80、160、320 µmol/L的CF干预后，与LPS组相比较，LPS+CF组均能明显拮抗LPS介导的HUVECs细胞的生长抑制（均P < 0.01)，并呈剂量依赖性，随着CF剂量增加，HUVECs存活率增加。

与空白对照组比较，aP < 0.01；与LPS组比较，bP < 0.01；n=5 图 2 不同剂量CF对LPS损伤HUVEC存活率的影响 Fig 2 Effect of different doses of CF on survival rate of HUVEC after LPS injury

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如图 3所示，正常组中几乎看不到凋亡细胞；而与正常组比较，LPS组部分细胞出现核固缩等早期凋亡特征，TUNEL阳性细胞显著增加, TUNEL阳性细胞数为(27.33±3.40)个；而LPS+CF（320 µmol/L）组较LPS组而言，TUNEL阳性细胞明显减少, 阳性细胞数为(11.67±2.04)个, 差异有统计学意义（t=5.578, P < 0.01）。

绿色：凋亡细胞；蓝色：DAPI；标尺为100 µm 图 3 CF对LPS诱导内皮细胞凋亡的影响 Fig 3 Effect of CF on LPS-induced apoptosis in HUVECs

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如图 4所示，与正常组细胞比较，CF (160 µmol/L)组细胞Bcl-2、Bax及Caspase3蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；而LPS组与正常对照组相比，Bcl-2蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）; Caspase-3和Bax蛋白表达上调, 差异有统计学意义（均P < 0.05);与LPS组相比，LPS+ CF（160、320 µmol/L）组Bcl-2蛋白水平升高, 差异有统计学意义（均P < 0.01）, LPS+CF (80、160、320 µmol/L)组Caspase-3和Bax蛋白表达均明显下调, 差异有统计学意义（均P < 0.01)。

与正常对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.01；n=5 图 4 不同剂量CF对LPS诱导内皮细胞凋亡蛋白表达的影响 Fig 4 Effect of different doses of CF on the expression ofapoptosis- regulated proteins in HUVECs

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如图 5所示，CF (160 µmol/L)组与正常对照组Nrf2和HO-1蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义; LPS组与正常对照组相比，Nrf2和HO-1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（均P < 0.01）；而与LPS组相比，LPS+CF (80、160、320 µmol/L)组Nrf2和HO-1蛋白水平均明显升高，且80 µmol/L CF组效果最佳，差异有统计学意义（均P < 0.01）。

与正常对照组比较，aP < 0.01；与LPS组比较，bP < 0.05；n=5 图 5 不同剂量CF对LPS诱导内皮细胞中Nrf2/HO-1信号通路活性的影响 Fig 5 Effect of different doses of CF on the activity of Nrf2/HO-1 signaling pathway induced by LPS in endothelial cells

图选项

2016年Sepsis 3.0正式提出，脓毒症是宿机体对感染的反应失调，导致危及生命的器官功能损害^[11]。渐进性器官功能障碍是脓毒症的标志，内皮系统是其中一个最大和最重要的器官，如果没有内皮细胞，血液流变学、凝血系统和器官灌注就会严重受损^[12]。另有研究发现，脓毒症中存在血管内皮细胞屏障功能的下降或丧失，是引起循环衰竭和组织器官水肿和损伤的重要因素^[13-14]。在脓毒症发展过程中，炎症介质诱导内皮细胞发生活化，并且活化的内皮细胞会继续产生大量炎症细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等, 加剧内皮细胞活化，使内皮细胞发生死亡和细胞凋亡^[15]，从而导致多器官功能障碍^[16]。因此，恢复血管内皮功能障碍，可能对有效预防和诊治脓毒症具有重要意义。

细胞凋亡是通过调控促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的细胞程序性死亡，从而达到维持自身内环境稳态的目的^[17]。Bcl-2是一种抗凋亡相关蛋白，在凋亡信号刺激下起到关键的阻止凋亡作用。Bax是一种促凋亡相关蛋白，其通常以无活性的单体形式存在于细胞液中。半胱天冬酶（Caspases）是凋亡过程中的的启动者和执行者，在细胞内通常以非激活的酶原形式存在，其中Caspase-3是Caspases级联反应下游最重要的促凋亡执行蛋白^[18-19]。在各类刺激信号的诱导下，Bcl-2通过抑制细胞色素c（Cyt-C）的释放进而阻断其上游Caspase活化，从而抑制细胞凋亡。当诱导凋亡时，Bax从细胞液迁移到线粒体和核膜进而促进Cyt-C释放，激活Caspase-9，进一步激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡^{[18, 20]}。

米糠是糙米的重要组成部分，含有丰富的生物活性植物化学物质，从米糠中提取的米糠油中主要含有植物甾醇谷维素，CF是植物甾醇谷维素的主要活性物质。植物甾醇的生物作用备受关注，它被认为具有多种生物活性，包括：降低胆固醇水平、降低血脂、抗氧化、消炎、抗肿瘤、提高免疫力、调节生长等^[21-22]。有研究表明，CF能抑制线粒体膜Caspase-3、Caspase-9的激活及相关促凋亡蛋白的表达，这些作用主要通过Nrf2/抗氧化反应元件(ARE)信号通路实现^[23-24]。本研究结果表明，CF处理能增高HUVEC存活率，抑制细胞凋亡，提示CF能改善LPS诱导的血管内皮细胞凋亡。从分子水平发现，CF能降低Bax蛋白水平，增加Bcl-2蛋白表达，抑制Caspase-3的活化。因此，笔者选择CF作为保护LPS诱导血管内皮细胞凋亡的物质，以期为脓毒症药物治疗提供新线索。

研究表明，细胞受到氧化应激会诱导产生凋亡，氧化应激导致的细胞凋亡与Nrf2 /HO-1信号通路的异常激活有关^[24]。Nrf2是抗氧化应激的一个内源性关键转录因子，在抗氧化和凋亡损伤的保护作用中起着核心作用，通过与ARE结合，激活包括HO-1的转录，其中HO-1是一种重要的抗氧化酶和细胞保护酶。Nrf2调节细胞的正常进化过程，如迁移、生长和凋亡，Nrf2/HO-1信号通路是细胞凋亡过程中的重要通路^[25-26]。故而本研究进一步检测了在LPS诱导的HUVECs的凋亡中，Nrf2信号通路的状态以及CF的作用。结果显示，经LPS刺激后的HUVECs中Nrf2及HO-1蛋白表达水平降低，而CF处理显著增加了Nrf2及HO-1蛋白表达。这提示CF可能通过提高Nrf2及HO-1的表达来减轻LPS所诱导的血管内皮细胞凋亡，表明CF对血管内皮细胞的保护作用可能与增强Nrf2信号通路转导有关。

综上所述，CF可显著抑制LPS诱导的血管内皮细胞凋亡，并通过调控Nrf2 /HO-1信号通路，对细胞产生保护作用，为CF在防治脓毒症血管内皮细胞损伤的临床应用提供理论依据。