2 广东省人民医院东病区、广东省老年医学研究所,广州 510080
2 Eastern Section, Guangdong General Hospital, Guangdong Institute of Geriatrics, Guangzhou 510080, China
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以气流持续受限为特征的慢性肺部疾病[1-2],气道、肺实质以及肺血管的慢性炎症被认为是COPD最重要的发病机制[2-3]。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是由垂体和多种细胞(B淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等)分泌的多效能细胞因子[4-6],在多种炎症相关性肺疾病中发挥重要的作用[7-8]。目前,关于MIF在COPD中的表达水平及其与COPD发生、发展的关系尚有争议[9]。本研究旨在探讨不同严重程度COPD人群肺组织中MIF表达水平的差异及与肺功能指标的相关性,分析其在COPD发病过程中的作用及可能机制。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取深圳市龙岗中心医院2015年1月至2018年9月因肺大疱行肺大疱楔形切除术患者的肺组织标本为研究对象(n=180)。所有患者术前均进行胸部CT和肺功能检查。依据病史资料、胸部CT及肺功能检查分为COPD病例组(COPD合并肺大疱行肺大疱楔形切除术患者,n=90)和对照组(经CT及肺功能显示肺大疱未合并COPD、支气管哮喘/肺囊性纤维化、支气管扩张、弥漫性细支气管炎等需行肺大疱楔形切除术的患者,n=90);慢阻肺诊断标准及严重程度分级参照中华医学会呼吸病学分会制订的2013年修订版COPD诊治指南[10]。根据慢阻肺诊断标准和肺功能指标病例组再分为:COPD轻度组(FEV1/FVC < 70%、FEV1/Pred%≥80%,n=30)、COPD中度组(FEV1/FVC < 70%、50%≤FEV1/Pred% < 80%,n=30)和COPD重度组(FEV1/FVC < 70%、30%≤FEV1/Pred% < 50%,n=30)。排除标准:1)术前2个月内呼吸道感染病史;2)合并其他肺部疾病;3)合并心、肝、肾等其他慢性系统疾病。所有标本的留取均已获得本院伦理委员会批准及受试对象或其家属知情同意。
1.2 研究方法 1.2.1 肺功能测定所有患者均于术前经肺功能仪(JAEGER公司 柏林 德国)测定肺功能指标(FEV1/FVC、FEV1/Pred%)。
1.2.2 标本的获取标本为尽量远离病灶(≥8 cm)的外周肺组织。手术取下肺组织标本立即置入液氮罐中,后移存于-80 ℃冰箱贮存,避免反复冻融。
1.2.3 RT-PCR检测MIF mRNA的表达MIF和β-actin引物由上海杰瑞生物工程有限公司设计合成(表 1)。使用Trizol(赛默飞世尔科技有限公司,上海,中国)提取肺组织RNA,紫外分光光度仪(上海精密仪器仪表有限公司,上海,中国)测定RNA纯度并定量(A260 nm/A280 nm值≥1.8者为理想),获得的RNA参照Takara逆转录试剂(宝生物工程有限公司,大连,中国)说明书合成cDNA。采用10 μL PCR的反应体系:Premix Taq 3.6 μL;逆转录cDNA模板1 μL;正向引物0.2 μL,反向引物0.2 μL;无核酶水5 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s, 68 ℃延伸2 min,39个循环; 68 ℃扩增7 min。反应结束后确认RT-PCR的扩增曲线和溶解曲线,依据各个扩增产物的CT值计算各组MIF mRNA的表达水平。
基因 | 基因序列 | 片段长度(bp) |
β-actin | 正向: 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3' | 285 |
反向: 5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3' | ||
MIF | 正向: 5'-GCACAGCATCGGCAAGAT-3' | 300 |
反向: 5'-GAGTTGTTCCAGCCCACATT-3' |
ELISA试剂盒购于上海BG公司。取液氮中保存的等量肺组织(50~100 mg)尽量剪碎,冰浴条件下用超声破碎仪充分匀浆后高速离心5 min,取上清液。按照ELISA试剂盒说明进行检测。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(A值),根据标准品A值绘制的标准曲线计算出相应细胞因子的浓度。
1.2.5 Western blot检测MIF的含量采用全蛋白提取试剂盒(凯基生物科技发展有限公司,南京,中国)进行蛋白抽提;BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所,上海,中国)进行定量;聚丙烯酰胺凝胶上样后电泳、转膜、漂洗封闭、加入一抗(博士德生物工程有限公司,武汉,中国)和二抗(碧云天生物技术研究所,上海,中国)、显影, 凝胶成像仪获取图像, 用FluorChem 8900自动图像分析软件对MIF光带的相对表达进行分析。
1.3 统计学方法采用SPSS 18.0软件,计量资料使用均数±标准差(Mean±SD)表示,组间两两比较采用SNK-q检验,多组变量间比较采用单因素方差分析,两计量指标间的相关性采用Pearson相关分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同组别临床资料的一般性描述本研究采用群体样本的一般性描述。对照组和不同COPD严重程度组间的性别、年龄等比较差异无统计学意义(P > 0.05);吸烟指数和体质量指数(BMI)比较差异有统计学意义(P < 0.05),见表 2。
组别 | 男/女 | 年龄(岁) | 吸烟指数(包/年) | BMI(kg/m2) |
对照组(n=90) | 45/45 | 56.53±7.33 | 36.46±13.20 | 24.30±5.70 |
COPD轻度组(n=30) | 15/15 | 58.88±9.02 | 47.84±12.45 | 24.01±5.10 |
COPD中度组(n=30) | 15/15 | 58.36±8.67 | 56.93±14.56 | 22.90±4.59 |
COPD重度组(n=30) | 15/15 | 55.83±11.55 | 69.04±15.77 | 20.92±4.12 |
F值 | 0.33 | 5.90 | 5.82 | |
P值 | > 0.05 | < 0.05 | < 0.05 |
病例组MIF mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05);按COPD严重程度分组,不同严重程度COPD患者肺组织中MIF的表达水平差异有统计学意义(P < 0.05),且随COPD病情严重程度的增加MIF的表达水平依次增加;肺功能指标(FEV1/FVC、FEV1/Pred%)随病情加重逐渐下降,两两比较差异有统计学意义(P < 0.05),见表 3和图 1。
组别 | FEV1/FVC(%) | FEV1/Pred(%) | MIF含量(pg/mL) | MIF mRNA相对表达 | MIF蛋白相对表达 |
对照组 | 92.01±12.45 | 90.60±22.45 | 55.90±2.20 | 1.41±0.30 | 1.31±0.26 |
COPD轻度组 | 61.84±11.23a | 81.41±21.88a | 80.80±3.20a | 2.10±0.45a | 2.64±0.56a |
COPD中度组 | 4.14±11.27ab | 65.44±10.41ab | 101.20±2.60ab | 3.05±0.53ab | 4.57±1.05ab |
COPD重度组 | 41.25±16.20abc | 37.94±6.95abc | 121.20±2.70abc | 4.54±0.92abc | 6.33±1.67abc |
注:COPD为慢性阻塞性肺疾病;与对照组比较,aP < 0.05;与COPD轻度组比较,bP < 0.05;与COPD中度组比较,cP < 0.05 |
2.3 病例组MIF的表达水平与肺功能指标的相关性
病例组MIF的表达水平与肺功能指标(FEV1/FVC、FEV1/Pred%)呈负相关(P < 0.05),见表 4。
指标 | FEV1/FVC | FEV1/Pred% | |||
r值 | P值 | r值 | P值 | ||
MIF含量 | -0.697 | < 0.05 | -0.751 | < 0.05 | |
MIF mRNA表达 | -0.457 | < 0.05 | -0.481 | < 0.05 | |
MIF蛋白表达 | -0.438 | < 0.05 | -0.446 | < 0.05 |
COPD是多种因素引起的全身慢性炎症反应综合征[11-12],炎症细胞和炎症因子在其发生、发展中起了重要作用[13]。MIF作为一种全身性致炎因子[14],参与了多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生及进展[15-17]。既往研究结果中,MIF在COPD人群中的趋势及表达水平各有不同[4-5, 9, 18-19]。本研究结果显示,病例组MIF的表达水平明显高于对照组,提示MIF可能与COPD的发病有关;随着COPD严重程度的加重,肺组织中MIF的表达增高,表达水平与肺功能指标显著负相关,进一步提示MIF在COPD发生、发展过程中可能起重要的作用,可作为反映疾病严重程度的客观指标。
COPD是多种因素(包括气道及肺实质的慢性炎症、氧化应激反应、蛋白酶/抗蛋白酶失平衡、肺实质细胞的坏死凋亡等)导致的慢性肺部缺氧性疾病。MIF作为一种多效能细胞因子,通过不同的机制作用于COPD的发生、发展过程:⑴气道炎症细胞浸润和炎症介质的释放是COPD发病的关键环节[20]。炎症因子刺激MIF大量分泌并与MIF相互促进,在COPD炎症反应及免疫应答中发挥重要的作用[21-24];⑵COPD是以产生低氧血症为后果的慢性肺部疾病。缺氧本身可刺激MIF分泌及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)大量表达,两者相互作用[25]介导COPD机体适应缺氧并减缓对机体的进一步损伤;⑶氧化应激可通过活化NF-κB信号通路增加炎症细胞的激活和炎症介质的释放,造成肺组织氧化损伤。随着COPD的加重,MIF的表达量增多,可通过调控Nrf-2减缓COPD氧化应激性肺损伤[26-27];⑷基质金属蛋白酶(MMP)在肺气肿、肺泡壁细胞外质破坏中起着重要作用。在氧化应激及炎症反应刺激下,单核巨噬细胞释放MIF增多,促进MMP-2及MMP-9的表达,降解肺组织弹力纤维、参与气道重塑,加速病情的恶化[28];⑸随着COPD炎症反应的加重和炎症细胞因子的增多,细胞坏死凋亡机制启动并加重,MIF的释放量增多,刺激血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮(NO)的表达,促进血管内皮生长因子分泌和肺部毛细血管再生,改善肺组织细胞的缺氧缺血;下调p16-RB和p53-21的表达,减缓肺泡上皮细胞凋亡及气道重塑,延缓COPD的发生、发展[29-30]。
本研究尚存在以下不足:(1)由于研究时间短、入组对象少、COPD肺组织标本难以获取等综合因素导致研究规模较小,影响研究结果的精确性和准确性,仍需更大规模的临床研究进一步验证;(2)病例组和对照组人群没有做到完全的匹配,研究方案需要进一步改进与细化以规避BMI等影响研究结果的干扰因素;(3)有文献报道[5],MIF在GOLD Ⅳ级COPD中的表达明显降低。由于COPD患者急性加重期时不能完成肺功能全面检查而未能在术中取得该级别肺组织标本并进行全面的研究;(4)本研究标本取自COPD合并肺大疱患者,未能完全排除肺大疱对MIF表达的影响及未能深入探讨肺大疱与MIF表达水平之间的关系。
综上所述,COPD肺组织中MIF的表达水平显著升高,和疾病严重程度及肺功能指标明显相关,为COPD发展机制研究提供一定的理论基础。
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