实验动物是一类广泛用于毒理学领域的研究对象，为科技发展做出了重要贡献。但无疑人类的科学活动对实验动物的伤害巨大，且基于动物的研究有许多已知的局限性：可能代价昂贵又耗时，且并不总能识别出与人类相关的毒性影响。1959年，由Russell和Burch提出的动物实验的3R理论^[1]，即减少（reduce）、优化（refine）和代替（replace），是生物医学研究中的重要原则。随着科技发展，针对毒理学研究中的动物实验进行优化甚至替代成为趋势。现对本领域研究进展论述如下。

1 毒理学研究中动物实验的缺陷

Knight^[2]曾总结了7项系统评价检验动物实验对人类毒理研究的贡献，没有一项能够清楚证明动物模型预测人类毒性的效用。究其原因可能是动物实验存在以下几点缺陷：单因素造模无法完全复制人类疾病的综合影响因素；不同造模方法反应的病理机制不同，所得出的毒性检测结果无法推广至所有模型；物种差异^[3]，也是最本质差异：表现为对疾病的易感性、药代/毒代动力学特性等的内在差异。使得实验动物不太可能精确模拟人类疾病的进展和对假定毒物的反应。

1.1 传统动物模型的不足

以啮齿类动物为主的传统动物模型，也是毒理学研究中最常见的动物模型。需注意以下因素可能导致啮齿类动物无法可靠预测毒物对人类的影响：已有许多实例证明由于代谢、激素调节等差异导致的啮齿类动物的毒理特异性，如CYP450酶表达差异、黄素单氧化酶（FMO）含量差异等^[4]。其次，常规实验程序中处理、约束动物产生的压力可能会改变动物的免疫状态和对毒物的易感性^[5]；另外，对于环境相关剂量的一般毒性损伤，如较低暴露剂量、较长间隔时间或较短的总暴露时间。啮齿类动物具有广泛的生理防御机制，如上皮脱落和诱导酶活化，使得这些更接近人类的暴露条件，都可能在啮齿类动物的毒性测试中呈阴性结果^[6]。

1.2 基因工程带来的新问题

自20世纪80年代中期，转基因、基因敲除与克隆技术在实验动物模型制作中得到广泛应用。研究毒理机制、识别药物作用靶点、进行新药筛选等毒理学研究领域也日益倚重基因工程模式动物。然而投资回报率却不断下降，从前期研发到临床应用之间的鸿沟难以逾越。其中一个关键原因是基因改造过程中始终有不可预测和不可控的脱靶效应等风险^[7]，使动物模型的准确性下降。

另一方面，基因治疗药物（gene therapy medicinal products，GTMPs）的出现，也为毒理学评估带来了新的挑战。与小分子化合物相比，基因治疗药物不但要考虑基因表达产品本身可能产生的生物活性，同时也要考虑转运载系统带来的安全性问题。因此模型相关性尤为关键，根据Silva Lima和Videira ^[8]提到的欧洲药品管理局等对于GTMPs监管准则，当一个动物模型未能满足相关要求时，可能有必要在多个物种或模型中测试GTMPs。

2 毒理学研究中动物实验的优化方法

在毒理学领域，“3R”中的“优化”原则强调的是对实验动物本身、对实验设计方案、对具体操作过程等多方改良。具体体现在合理选择动物种属、减少动物使用、减少实验影响因素、缩短实验周期、降低实验成本、阐明毒性作用机制以及进行合理统计分析等诸多方面。其目的不仅仅是改善动物福利，更是最终为促进研究结果的人类转化而努力。

2.1 优化实验设计

科学严谨的实验设计可以尽可能减少动物实验的偏差倾向，更有利于研究者获得用以评估对应人类风险所真正需要的信息。针对毒理学研究最常用的实验动物，Perrin提出四个可避免啮齿类动物实验假阳性结论的实验设计^[9]：①排除实验操作中一切可能的干扰因素；②平衡性别；③将同窝动物分入不同组别；④追踪基因。Hackam研究发现^[10]，动物实验向临床研究转化的成功率不受动物种类、疾病种类或治疗方案、发表期刊及出版年份、方法学质量、甚至是文章引用率的影响，然而，纳入剂量反应剃度的动物研究更有可能转化为临床试验。提示在毒理学研究中进行剂量梯度实验的重要性。

Ioannidis等^[11]总结并提到以下四种可以降低动物实验偏倚风险的措施：①随机分组；②盲法评估实验结果；③介绍样本量的计算方法；④研究者就真实的利益冲突发表声明。Macleod等^[12]总结了2 671份有关动物疾病模型的功效研究，结果发现以上这四项措施都尚未广泛用于动物研究中，尤其是样本量计算问题。当然没有报道偏倚降低措施并不意味着结果不可信，相反，报告相应措施的也不能保证完全按措施执行。但既往研究表明^[13]，较少提及减少偏倚措施的论文倾向于报告候选药物的较高疗效，说明这种偏倚措施的报告与否可以作为研究严谨性的参考指标。

2.2 优化动物选择

并不是只有啮齿类动物才是毒理学研究的最佳选择。Olson等^[14]研究发现，啮齿类动物的毒性检测只能预测出43%的人类风险；非啮齿类动物研究预测能力达到63%；两种物种的组合能将预测能力提高到约71%。因此国际协调委员会（International Committee on Harmonization，ICH）要求在候选药物进入临床试验以前，通常要在第二类物种（非啮齿类动物）上进行动物实验。

例如可以选择鱼类作为另一种有效的毒理学实验动物：特别在参与环境危害和风险评估时，可进行急性鱼类毒性测试^[15]。斑马鱼（danio rerio）是其中一类典型代表，其易于繁殖，维护成本低，和人类基因有着87%的高度同源性。且对药物、毒物十分敏感，极微量的成分就可以引起很强的反应，在毒理学研究具有极强的优势，成为研究毒素对肝脏^[16]、骨骼^[17]、发育^[18-19]等影响的优秀模型。

在涉及动物实验的研究项目时，可参照欧盟地平线2020计划（Horizon2020）中的提问清单^[20]，完成研究人员针对动物实验的自我评估（2018年6月26日更新版本），针对研究动物的选择提供详细信息，说明为何必须使用动物以及选择特定物种的理由，以便促进选择实验动物时的优化。

2.3 优化操作步骤

除了优化实验动物本身，在毒理学研究中改进实验方法也成为研究热点。如研究药代/药效动力学（PK/PD）时的取样改进，如毛细管微量取样^[21]：这一精细取样技术，能够以较小的影响对动物进行重复血液采样，使得在相同的动物中同时获得了暴露和药物功效和（或）毒性数据，减少动物使用总量的同时提高了研究质量。另外，目前的生物分析高通量质谱仪能够实现盒式给药（cassette-dosing approach）^[22]，该方法可以在中枢神经系统毒物暴露后筛选一组新分子的PK，与传统的给药剂量相比，最大限度地减少动物的数量。

2.4 优化结果评估

动物研究数据结果的正确处理和评估，是确保从实验结果中正确提炼有用信息的前提。一种合理评估的工具是系统评价（systematic reviews, SRs）。2014年推出的基于证据的临床前医学系统评价^[23]，可提供关于动物研究信息丰富的摘要检索。下一步将是制定解释动物研究SR结果的指导规范，并评估证据质量。国际GRADE工作组已经对此进行了探讨^[24]，他们通过采用目前对临床研究证据分类分级的最高水平“GRADE”分级方法（即建议，评估，发展和评价）。从证据分级出发，整合了分类、分级和转化标准，来尝试对动物实验研究证据质量进行评估，可能有助于提高将实验动物研究中的发现转化为人类研究和临床实践的可能性，促进医疗决策。

3 毒理学研究中动物实验的替代方法

随着科技进步以及3R原则的不断强化，毒理学研究中一个问题被广泛提出：即所有的体内实验（动物实验）研究是否值得？每年大量文献报道动物模型的研究中究竟有多少是实际有用的，已有学者对动物实验的实际价值存疑^[2]。替代方法^[25]（alternative methods）通过采用非动物性检测系统或使用种系发育较低级物种来代替动物使用，是3R原则的科学体现。自本世纪以来，替代技术在毒理学研究中逐步开发并得以广泛应用，形成了一套成熟的法律法规及验证体系，其中创新研发的实验工具或方法亦具有产业化的前景。

3.1 验证体系与法规建立

验证是新的替代方法被法规认可的前提条件。国际上最早成立的验证机构是欧洲替代方法研究评价中心（EURL-ECVAM），随后，美国（ICCVAM）、日本（JaCVAM）、韩国（KoCVAM）、印度（InCVAM）、巴西（BaCVAM）验证中心也先后成立。这些官方机构的成立使得大量研发投入产生的新技术、新方法和新产品有了被法规认可的渠道，旨在从国家层面推动替代技术的进步，并据此形成各国各地区相关法规和禁令。影响最为深远的是始于1994年编制并不断更新的世界经济合作和发展组织（OECD）替代方法验证指南，其内容被国际广泛接受并参照执行。

中国在替代方法的标准认证方面也紧跟国际步伐。率先在化妆品安全评价领域成立化妆品行业标准专家委员会，并先后发布了《GB/T 21769—2008 化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》、《GB/T 27828—2011 化学品体外皮肤腐蚀经皮电阻试验方法》等相关替代方法标准共18项^[26]，目前这批填补国内空白的相关标准已在检验检测工作中得到广泛应用。

3.2 新理论与新系统

鉴于动物实验替代技术的不断革新，尤其是毒理学领域所面临的工业化、全球化安全评估、产业发展、环境评价等新问题，既有的研究理论与研究体系已不能满足毒理学科的发展需要。2007年，美国国家研究委员会（NRC）报告——《Toxicity testing in the 21st century: A vision and a strategy》（《21世纪的毒性检测：愿景与战略》）（简称NRC 2007），提出为评估化学物质对人类健康的影响，展望出一个更有效、更具预测价值且更经济的新系统^[27]。在这一新系统下，各种新概念、新方案被提出，以促进实现NRC 2007报告中所明确表达的愿景。

这些新方案包括：有害结局路径（adverse outcome pathway，AOP）概念^[28]：用于描述从分子起始事件（molecular initiating event，MIE）到“有害结局（adverse outcome，AO）”之间的联系；检测与评估的整合方案（integrated approaches to testing and assessment，IATAs）^[29]：标准方法的改进和组合；数据解释的推荐作用模式（mode of action，MOA）^[30]：引入分级系统来评估动物研究的必要性。

2013年，ICCVAM建立了新方案战略性发展蓝图^[31]，采纳术语“新方案方法论（new Approach methodology，NAMs）”作为美国毒性检测建立的新理念。NAMs泛指毒理研究中任何非动物技术、方案或这些技术方法的结合。此外国际上一系列战略推进项目（美国环保署ToxCast筛选计划、21世纪毒理学（Tox21）、欧盟AXLR8及SEURAT-1项目等）的开展预示着毒理学科新时代的到来。

3.3 替代技术的开展与应用

传统替代技术主要指利用体外实验系统，如体外培养的细胞、组织、离体材料和重建的组织/器官等取代动物实验系统的技术方法。表 1总结了2011-2017年间获OECD测试指南认可或进行更新的替代技术。2011年以前认可的替代技术未列入表中，如Ian Kimber及其团队开发的局部淋巴结检测（Local Lymph Node Assay，LLNA）^[32-33]。

目前针对传统替代技术的改良仍在继续，使替代技术向更复杂的系统性毒性和靶器官毒性深入。如：①基于三维组织重建技术的新型体外试验系统的开发，如人体组织器官芯片技术（organ-on-a-chip，OOC）^[34]，可以在体外重现体内器官环境，既能有效反应毒物暴露对于生理的影响，又能像体外实验一样精确控制。目前已发表的研究成果包括肠道、肝脏、肺脏、心脏、血管、肿瘤、胎盘、眼以及人体在内的9种芯片。②基于诱导多能人类干细胞（induced pluripotent human stem cells，iPSCs）的技术开发，如微生理系统（microphysiological systems）^[35]，与动物实验相比，这些系统可能更好地预测人类的反应。③基于各类组学（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）技术结合生物信息学技术的开发，使得以往难度较大的低剂量水平的体外毒性测试仍然能够获得丰富的指标用以观察生物学变化过程。

另一方面，由于人体细胞和组织时常因伦理问题而造成的可用性受限，以非生物测试方法（non-biological testing methods）为代表的新型替代技术逐渐挑战了基于细胞系和组织资源的传统体外研究。非生物测试方法^[36]指任何基于计算机开发的，可用于检测全身毒性的预测方法。如定量构造-活动关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型；基于生理学的动力学（quantitative structure-activity relationship，PBK / D）模型；基于虚拟细胞分析（virtual cell based assay，VCBA）模型；分组和交叉参照（grouping and read-across）。在OECD制定的验证和记录QSAR模型指南监管下，已经有不少QSAR模型和工具应用到毒理学安全性评估中，特别是制药工业的研发阶段，如Toxmatch和Toxtree等计算工具，以及ChemAgora和CheLIST等在线资源咨询毒理学数据库。

4 总结

动物实验作为传统的毒理学研究方法存在较多的弊端，在3R原则的实践中不断发展和完善动物实验，探索更合理的优化方案以及替代方法是最终促使动物实验向人类成功转化的必要途径。现代毒理学的研究方法将更少运用单一替代方法来取代动物试验，而更多强调结合了成套分析、计算机模拟方法的NAMs。随着科技向前发展，毒理学研究进入了NAMs的发展以确保适用性为“最终目的”的新模式中，理解并处理好传统方法的缺陷是至关重要的。在我国政府重视和支持下，必将进一步推动动物实验替代方法研究与验证体系在我国的建设。