急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是急性重症胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）的最常见早期并发症之一，由肺损伤持续加重导致且进一步可发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）甚至危及生命，然而其确切发生机制尚不完全清晰，可能与ANP时大量炎症因子释放有关^[1]。由于调控这些炎症因子产生的信号通路主要为Toll受体家族（toll-like receptor，TLRs）介导的核转录因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等信号通路^[2]，而脂氧素A（lipoxin A，LXA）具有抑制白细胞游走、抑制黏附分子表达、拮抗白三烯等功能，脂氧素A4类似物（Lipoxin A4，LXA4）是体内炎症反应的重要抑制因子^[3]，因此，本研究分析了Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/NF-KB信号通路在急性重症胰腺炎相关肺损伤中的作用，并探讨了LXA4的干预结果，旨在为临床急性重症胰腺炎相关肺损伤的治疗提供参考依据。

牛磺胆酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司。采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶含量（检测试剂盒购于Sigma公司）。应用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量（检测试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司）。应用微生物快速动态监测系统检测血清内毒素含量（检测试剂盒购于天津一瑞生物工程有限公司）。

清洁级健康雄性SD大鼠（SCXK(陕)2018-001）45只，体质量200~300 g，购于本校实验动物中心，在安静、温暖（18~25℃）、避强光、昼夜光照节律的实验室饲养1周后供本研究实验所用，自由饮水和摄食。为每只SD大鼠编号，按照随机数字表法分为假手术组、实验组、干预组，每组15只。本研究经西安交通大学动物实验伦理审批（XJTULAC2019-1150）。

实验组：动物于术前12 h禁食，不禁水^[4]。术前腹腔内注射10%水合氯醛3~4 mL/kg麻醉^[5]，达到满意麻醉状态后腹部备皮，剑突下腹正中开腹，找到十二指肠及胆胰管，阻断胆总管出肝门处，静脉留置针穿刺胆胰管开口处的十二指肠对侧壁，进入十二指肠肠腔，退出针芯，进入套管，按1 mL/kg体质量的剂量缓慢（0.1 mL/min）注射4%牛磺胆酸钠10 min^[6];注射完毕应用血管钳夹闭胆总管入十二指肠处5 min^[5]，肉眼可见充血、水肿时提示造模成功，随后缝合、关腹; 所有实验操作在无菌操作下完成。

假手术组：胆胰管内不注入牛磺胆酸钠，其余操作同实验组。干预组：于造模后30 min经尾静脉注射LXA4，具体剂量参考文献^[7]标准（87.5μg/kg）。假手术组和实验组均于造模后30 min经尾静脉注射等量生理盐水。

将各组15只大鼠随机分为3组，每组5只，分别于术后6 h、12 h、24 h采用腹主动脉抽血法处死。采集血液后抗凝、离心，采集血清; 取胰腺和肺组织。

（1）大鼠术后血清淀粉酶、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、内毒素水平检测

（2）大鼠术后肺损伤学评分、肺湿/干质量比值取右肺上叶进行常规病理检查，参考Osman肺脏组织学评分^[8]标准进行肺损伤评分，从“肺组织水肿”，“肺泡组织中性粒细胞、肺间质单核细胞浸润”，“肺组织出血”三个层面进行评分，评分范围0~9分，分数越高表明肺组织损伤程度越严重。

取左肺称质量，电热干燥箱烘烤（60℃，48 h），称干质量。计算肺组织湿/干质量比值^[9]=（肺湿质量-肺干质量）/肺干质量。

（3）大鼠术后肺组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达检测取10 g右肺中叶，匀浆，常规进行Western-blot检测。TLR4、NF-κB p65蛋白一抗及二抗均购于美国Sigma公司，实验结束后经图像分析软件进行分析，以平均灰度值表示TLR4、NF-κB p65蛋白的相对含量。

实验数据应用SPSS 21.0软件分析，计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

统计结果显示，实验组、干预组术后6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6、内毒素水平均明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）; 干预组术后6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6、内毒素水平均明显低于实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

实验组术后6 h、12 h、24 h的肺损伤学评分、肺湿/干质量比值均明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）; 干预组术后6h肺损伤学评分与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但术后6 h肺湿/干质量比值以及12 h、24 h的肺损伤学评分、肺湿/干质量比值均明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）; 干预组术后6 h、12 h、24 h的肺损伤学评分、肺湿/干质量比值均明显低于实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）。且肺损伤学评分，实验组术后12 h与6 h比较差异无统计学意义（P＞0.05），术后24 h与术后12h比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

实验组、干预组术后6 h、12 h、24 h的肺组织中TLR4、NF-κB p65表达水平均明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）; 干预组术后6 h、12 h、24 h的肺组织中TLR4、NF-κB p65表达水平均明显低于实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3，图 1。

图 1 术后不同时间点肺组织中TLR4、NF-κB p65蛋白的表达 Fig 1 Expression of TLR4 and p65 proteins in lung tissues at different time points after operation

图选项

ANP的最常见早期并发症是ALI，其发病率约15%~60%，可由肺损伤持续加重导致，且进一步可发展为ARDS。有统计结果显示，60%~80%发病后1周内死亡的ANP患者均与ALI和（或）ARDS有关^[10-12]。目前，ANP相关肺损伤的确切发生机制尚不完全清晰，得到证实的是TLRs家族的TLR4与其主要配体内毒素结合后被激活，致使ANP发生，同时可导致NF-κB活化，而激活的NF-κB信号通路可触发炎症介质瀑布样级联反应并导致大量炎症因子释放^[13-15]，进而参与胰外脏器损伤的发生发展过程。其中TNF-α、IL-6等促炎因子不仅在ANP的发病中发挥了核心作用，也是诱发最终多器官功能障碍的重要^[16]因素。

本研究采用牛磺胆酸钠进行胆胰管逆行注射法造模，是目前最常用且最稳定的ANP造模方法^[17-20]。目前国内广泛采用的是Zhang等^[4]的方案，即采用3.5%牛磺胆酸钠进行造模，但是，袁琳等^[21]研究发现，采用5%牛磺胆酸钠进行造模优于3.5%浓度，而Zhang等^[6]采用4%浓度也获得了稳定的模型，因此，笔者进行预实验，采用4%牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射法造模，随后通过对胰腺组织的观察、判断以及病理学检查、Schimidt评分^[22]并结合淀粉酶等指标，发现采用4%牛磺胆酸钠进行胆胰管逆行注射法造模，可以稳定制造ANP模型，且符合ANP的生理、病理表现。因此，本研究采用该方案造模，随后观察各组大鼠术后不同时间点血中炎性细胞因子、内毒素的水平变化情况。结果显示，实验组、干预组术后6 h、12 h、24 h的TNF-α、IL-1β、IL-6、内毒素水平均明显高于假手术组。说明TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子参与了ANP相关肺损伤过程，可能与高水平的内毒素与TLR4的结合从而活化NF-κB信号传导通路有关。干预组术后6 h、12 h、24 h的TNF-α、IL-1β、IL-6、内毒素水平均明显低于实验组。说明经过LXA4的干预，能够对ANP发生时体内炎症反应等病理过程发挥一定的抑制作用，LXA4可能为体内重要的内源性促炎症消退介质。

脂氧素是二十烷家族的代谢产物，具有抑制白细胞游走、黏附分子表达、拮抗白三烯等功能，LXA4是体内炎症反应的重要刹车信号^[23]，已有研究结果证实，在减轻肺损伤、血管内皮细胞损伤、缺血-再灌注损伤等病理过程中，LXA4均发挥重要的保护作用^[24-26]。进一步研究各组大鼠肺损伤的情况，结果表明实验组术后6 h、12 h、24 h，以及干预组术后12 h、24 h的肺损伤学评分、肺湿/干质量比值均明显高于假手术组; 干预组术后6 h、12 h、24 h的肺损伤学评分、肺湿/干质量比值均明显低于实验组，且术后6 h肺损伤学评分与假手术组比较差异无统计学意义，证实了经过LXA4的干预能够明显的减轻ANP相关肺损伤的程度。实验还发现，实验组术后12 h肺损伤学评分与6 h比较差异无统计学意义，术后24 h与术后12 h比较差异无统计学意义，说明应用LXA4可以延缓肺损伤的进展，进一步证实了LXA4对ANP相关肺损伤的潜在治疗作用。

为了进一步分析NF-κB信号传导通路在ANP相关肺损伤中的表达和LXA4的干预效果，经Western-blot实验检测了各组大鼠术后不同时间点肺组织中TLR4、NF-κB p65的蛋白表达情况，结果证实：TLR4、NF-κB p65的蛋白表达与TNF-α、IL-1β、IL-6、内毒素的变化具有类似趋势，进一步证实了TLR4、NF-κB参与了ANP相关肺损伤的发病过程以及LXA4的积极干预效果。